分子生物学实验探讨.docVIP

分子生物学实验报告 姓 名： 学 院： 专业班级： 学 号： 一、前期工作及引物设计 （一）实验目的： 寻找一个合适的基因，并设计出与之相对应的引物，用于后续实验。 （二）实验原理： 引物设计的一般原则： ① 引物长度：15-30bp ② GC含量：一般引物序列中G+C含量一般为40%~60% ③ 退火温度：退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加 ④ 避免扩增模板的二级结构区域 ⑤ 与靶DNA的错配：当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测 ⑥ 引物末端：引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 ⑦ 引物的二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 （三）操作方法： 1、阅读一些与小麦抗旱基因相关的文章，并最终选出基因TAPK7。 LOCUS AB125308 1583 bp mRNA linear PLN 15-FEB-2008 2、根据引物设计原则，用相关软件Primer6设计两对引物。 3、在网站NCBI上用BLAST检验所设计的引物，并从中选出较好的一对引物。 （四）实验结果： 前引物：5’-CCAACATCATCCGCTTCA-3’（position:396 引物长度：18） 后引物：5’-CCTGCTCATCCTCCTCTT -3’（position:1190 引物长度：18） （产物长度795） （五）讨论： 虽然我们自己设计出来引物，但是后来做PCR的效果也不好，后来还换了引物。所以希望老师能在这些我们还未学习到的地方给一些经验指导，或者提供一些资料参考，来保证我们的实验效果。 二、目的基因提取及验证 （一）实验目的： 根据所设计的引物，用克隆基因组和反转录两种方法，得到目的基因cDNA。 （二）实验原理： 1、提取基因组：十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片，下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。 2、提取RNA：DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。RNA提取的另一个关键问题就是抑制或去除环境中RNA酶，判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）。 3、利用提取的基因组和设计好的引物一起做PCR，便可得到目的基因。利用提取的RNA和设计的引物一起做RT-PCR，便可得到目的基因的cDNA。之后再做电泳检验扩增出的条带是否和目的基因的分子量大小相符。 （三）实验步骤： （1）基因组DNA提取 1. 取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700μl抽提液（65℃预热）混匀，加4 ul RNase室温静置2min。放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。 2. 取出裂解好的DNA ，加入700μl 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（10000rpm，10分钟）。 3. 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。 4. 将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。 5. 去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，挥发除去乙醇，溶于50μl TE或水中。 （2）提取RNA： 1. 称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。 2. 加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。 3. 加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。 4. 冷冻离心12 000 rpm×15min。 5. 将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀，-2