原位杂交-经典方法-地高辛标记探针.doc

原 位 杂 交 (In situ hybridization) 目的 掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。 原理 原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。 原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 仪器设备 烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。 材料和试剂 1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。 2．试剂： Davidson’s AFA固定液: 330 ml 95％乙醇 220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液） 115 ml 冰醋酸 335 ml H2O 混匀后封口，室温放置； DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）； TNE： 50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base 10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl 1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTA ddH2O 900 ml （定容至1L） 用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存； 0.4% 甲醛： 37～39％% 甲醛 5.4 ml ddH2O 495 ml； 蛋白酶K溶液 (Pr.K，10 mg/ml)： 10 mg Pr.K 溶于1 ml TNE中（用时现配）； 20×SSC：3 mol/L NaCl 175.32 g NaCl 0.3 mol/L柠檬酸钠 88.23 g 柠檬酸钠 ddH2O 900 ml （定容至1L） 调pH至7.0，高压灭菌，4℃保存； 2×SSC： 20×SSC 100 ml ddH2O 900 ml 0.45 μm 滤膜过滤，4℃保存； 20×Denhardt’s溶液： 0.4％ 牛清血蛋白 0.4 g牛清血蛋白 0.4％ 聚蔗糖 0.4 g聚蔗糖 0.4％ 聚乙烯吡咯烷酮 0.4 g聚乙烯吡咯烷酮 ddH2O 100 ml 0.45 μm 滤膜过滤，4℃保存； 25％硫酸葡聚糖：25 g硫酸葡聚糖溶于80 ml ddH2O（定容至100 ml），-20℃保存； 杂交液： 4×SSC 50% 甲酰胺 1×Denhardt’s 5% 硫酸葡聚糖 0.5 mg/ml鲑精DNA 4℃保存； BufferI： 100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base 150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl 用HCl调pH至7.5，定容至1L，高压灭菌，4℃保存，； BufferII： 0.5% Blocking agent 0.5 g Blocking agent BufferI 100 ml 低温加热溶解，4℃保存一星期； BufferIII： 100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base 100 mmol/L NaCl 5.84 g NaCl 50 mmol/L MgCl2 10.16 g MgCl2?6H2O ddH2O 990 ml（定容至1L） 用HCl调pH至9.5，0.45 μm 滤膜过滤，4℃保存； BufferIV：10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/LEDTA； 显色液（NBT/BCIP使用液）：20 μl NBT/BCIP + 1ml BufferI