基因定点突变方法及其应用.docx

基因定点突变方法及其应用摘要：本文综述了基因定点突变的三种方法，在此基础上的一些改进方法及其应用，并对这三种方法进行了比较。关键词：定点突变；寡核苷酸引物；PCR；盒式突变Methods of Site-directed Mutagenesis and Their ApplicationAbstract: In the paper，methods of site-directed mutagenesis，some advanced methods on the basic methods and their application are present. At the same time，the comparison are made .Key words: site-directed mutagenesis；oligonucleotide；PCR；cassette mutagenesis定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变牢高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段，在生物和医学领域中的应用非常广泛。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变等[1]。1常用定点突变方法1.1核苷酸引物介导的定点突变其原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要的过程(见图1)：①将待突变基因克隆到突变载体上；②制备含突变基因的单链模板；③引物与模板退火5’端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA，④合成突变链：在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产牛闭环的异源双链的DNA分子；⑤转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因；⑥对突变体基因进行序列分析。1.2 PCR介导的定点突变经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应(见图2)。头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA。1.3盒式突变盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。这对于确定蛋白质分子中不同位点氨基酸的作用是非常有用的方法。2 定点突变方法的改进2.1 寡核苷酸引物介导的定点突变的改进该方法常产生突变效率低的现象，其主要原因是大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统所致。针对这一问题，KUNKEL[2]进行了改进，用尿嘧啶取代DNA的选择作用提高了突变效率。近几年来，多家生物公司又进行了进一步的完善，并相继推出了本公司的产品。据不完全统计：Promega公司研制了Alter sitesⅡin vitro Mutagenesis system，安法玛西亚公司研制了Unique Site Elimination Mutagenesis Kit，Stratagene公司研制了Quik change Site—DirectedⅣMutagenesis Kit，伯乐公司研制了Muta-Gene in vitro Mutagenesis Kit，这些试剂盒各有特色，它们的共同之处有：①采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体，大大降低了突变修复频牢。②采用改进后的质粒，省去了制备单链模板的烦琐步骤，节省了时间。③增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多对敲除/修复引物，使得在该质粒上可以连续进行不止一次的突变反应，使突变反应更加快速、简便。这里简单介绍一些Stratagene公司的/buyf/productsf/STRATAGENE/openfi