邻苯二酚加氧酶的发酵及提纯1.docVIP

邻苯二酚加氧酶的发酵及用双水相法的分离提纯 摘要：本实验以苯酚降解菌一种假单胞菌为菌种发酵获得了可以降解苯酚的酶邻苯二酚加氧酶，并以双水相法加以提纯。结果显示，该假单胞菌经过发酵获得了邻苯二酚加氧酶，在双水相法萃取时选用PEG6000与不同体积的缓冲溶液融合后，只有当PEG6000与缓冲液体积为1/1.6时，上下相及混合相酶活才存在。本实验为以双水相法提取生物活性物质奠定了基础。 引言：苯酚被大量用于制造酚醛树脂以及其他高分子材料、药物、燃料、炸药等。随着近年来工业对于苯酚的需求日益增加，苯酚对于环境的污染也日益加重[1]，这对人类也有极大的危害性。已有研究对微生物降解苯酚的途径进行了解释[2]，也有对邻苯二酚双加氧酶的结构和功能的研究的报道[3] 。降解苯酚的代谢是将苯酚分解为邻苯二酚，邻苯二酚由邻位和间位途径经环裂解，最后形成2-羟粘糠酸半醛。邻苯二酚加氧酶是降解本分的关键酶所以邻苯二酚加氧酶在降解苯酚的途径中起着重要的作用。虽然已经有以双水相萃取生物物质[4] 的报道，但还没有以双水相发萃取邻苯二酚加氧酶的报道。自然界中，存在着许多具有降解芳香族化合物能力的细菌。本实验从化学工厂的污水中分离出能够降解苯酚的假单胞菌。并以此菌进行发酵，并将发酵后的产物用双水相法进行分离、提纯出邻苯二酚加氧酶。开展本实验，可以为以降解苯酚的工程菌进行发酵、以双水相法萃取直接得到降解苯酚的关键酶奠定基础，以更加有效的方法改善污染。 1 材料与方法 1.1 材料 供试菌为从污水中分离出的假单胞菌 1.2 培养基 用假单胞菌生产邻苯二酚加氧酶过程中使用的培养基及组成见表1。 表1. 假单胞菌各阶段培养基 培养基种类 成份 种子培养基 3gL-1 牛肉膏+10gL-1蛋白胨+5gL-1NaCl+20gL-1（pH7.0） 富集培养培养基 3gL-1 牛肉膏+10gL-1蛋白胨+5gL-1NaCl（pH7.0） 无机盐培养基 6gL-1Na2 HPO4+3gL-1KH2 PO4+0.5gL-1NaCl+1gL-1NH4 Cl+200mg L-1酵母膏+0.24gL-1MgSO4 +0.011gL-1CaCl（pH6.5-6.8） 发酵培养基 无机盐培养基+500mgL-1苯酚 1.3 菌液制备 将已经分离得到的苯酚降解菌假单胞菌接到种子培养基上，在30℃下培养24h。之后将种子培养基上的菌体转接至装液量为50ml/250ml三角瓶中（10瓶/组），在37℃下以200r/min摇瓶18h。在4-10℃下以10000r/min的速度离心15min，共离心两次。将得到的菌泥进行碳饥饿培养。 1.4 苯酚降解菌的发酵培养、菌体细胞的收集及破碎 50L的发酵罐中添加10L的发酵培养液，灭菌、冷却后将至的的接种液接入发酵罐里，30℃，1:1（v/v）通风量，搅拌速度为300r/min发酵培养24h。发酵液在10℃下10000r/min离心5min收集细胞菌泥。菌泥用磷酸盐缓冲液（pH7.5）冲洗两次，重选在10-50ml相同缓冲液中，在冰浴条件下超声破碎3min，功率300W，所得粗提物于4℃，10000r/min离心30min得上清液。 1.5 PEG6000与酶的共沉淀及复溶 将酶粗提液在冰浴条件下先缓慢加入PEG6000并不断搅拌混合均匀，静置1h待PEG与酶混合稳定后再加入固体（NH4）2SO4至饱和，低温静置6小时。然后再4℃、1000r/min离心10min，得到PEG与蛋白质的盐析复合沉淀物。PEG与蛋白质的盐析复合沉淀物分成5份（分别为1号1.62g、2号1.60g、3号1.61g、4号1.58g、5号1.54g），分别置于10ml离心管中按一定质量比加入pH7.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解复合沉淀物（比例为沉淀/缓冲液=,1/0.8,1/1.6,1/2.0和1/2.4），经过3000转/每分钟离心5分钟形成不同组成相的PEG/磷酸盐双水相体系。 1.6 邻苯二酚加氧酶酶活力的测定 配置100mg/L苯酚溶液。分别取10ml苯酚溶液+0.5ml酶液（对应5组双水相当中的、上相、下相、混合相）。利用液相色谱法分别测定酶解前的苯酚浓度[phe1]，在30℃水浴经过一小时后测得酶解后苯酚浓度[phe2]。 2 结果 2.1 苯酚降解菌假单胞菌的活化 在经过种子培养基的固体培养后，成功的使菌体活化长出菌落。菌落呈乳白色，形状不规则，是类圆形的多边形。菌落表面潮湿、光滑。（见图1） 图1：假单胞菌在种子培养基上活化培养24h后形成的菌落 2.2 PEG6000与酶的共沉及复溶 经过不同缓冲体系的共沉及芙蓉后，邻苯二酚加氧酶及其他酶成功的在PEG6000与水的双水相中分离，得到