两种微量RNA扩增方法的比较研究.pdfVIP

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(4): 391-396 两种微量RNA扩增方法的比较研究 陈林华*　赵月娥 陈晓燕　高　英 (温州医学院附属眼视光医院, 温州 325027) 摘要 本研究通过比较体外转录和单引物扩增这两种扩增微量RNA的不同方法, 以寻找一 种高效的扩增方法。我们用两种不同方法分别扩增小鼠大脑全皮层及第五皮层细胞的RNA, 扩增 的RNA合成cDNA后进行荧光定量PCR实验, 根据PCR结果比较两种不同扩增方法的效率。WT- ovation扩增RNA的效率约为IVT效率的2.8倍; IVT方法扩增后, 基因D-Ct值与引物距离mRNA 3’端 的长度及mRNA的长度均存在正线性相关(P0.05), 即引物距离mRNA 的3’端越近、mRNA越短, 基因D-Ct值越低。而WT-ovation方法扩增后, 基因D-Ct值与引物距离mRNA 3’端的长度及mRNA的 长度均不存在统计学相关性。与IVT方法相比, WT-ovation方法效率更高, 扩增时受影响因素较少、 更稳定。 关键词 RNA扩增; IVT扩增; WT-ovation扩增; 定量PCR 收稿日期: 2010-12-22 接受日期: 2011-01-20 国家自然科学基金(No, 浙江省自然科学基金(No.Y2100855) 和温州医学院附属眼视光医院科研启动基金(No.KYQD090701)资助项目 *通讯作者。Tel: 0577 E-mail: chenlinhua14159@yahoo. 随着激光捕获显微切割技术(laser capture mi- crodissection, LCM)的发展, 现已能够从含有不同成 分的组织中高度选择性地获取某一特定的同类细胞 甚至单个细胞。近年来发展起来的基因芯片技术[1,2], 使我们能够检测组织或细胞中大量基因的表达情 况。但典型的芯片杂交需要大于2 mg mRNA, 直接 来源于LCM的细胞很难提取足够量的mRNA用于基 因芯片分析[1,3]。 Van Gelder[4]和Eberwine[5]发明了一种基于cDNA 合成和模板指导多循环线性方式的RNA扩增方 法 [6,7]。Eberwine法中的体外转录(in vitro transcrip- tion, IVT)扩增, 是利用Oligo dT引物对mRNA进行反 转录为cDNA, 再将mRNA-cDNA用RNase H处理以 合成双链cDNA, 然后在T7 RNA聚合酶作用下进行 体外转录, 合成反义RNA(antisense RNA, aRNA)的 线性扩增。单引物扩增(single primer amplification, SPA)方法是利用DNA聚合酶, DNA/RNA、随机引 物、Oligo dT等引物对mRNA进行扩增, 合成RNA/ DNA稳定的中间产物, 再不断循环扩增出cDNA产 物。美国Nugen公司用SPA原理, 研发了WT-ovation 试剂盒。本研究通过比较IVT和WT-ovation这两种 扩增微量RNA的不同方法，以寻找高效的扩增方法。 1 材料与方法 1.1 实验对象 清洁级美国癌症研究所(Institute of Cancer Re- search, ICR)小鼠, 来自并繁殖于温州医学院动物实 验室。 1.2 实验材料 MEM(modified Ealge’s medium)、TRIzol、Su- perscript III Firststrand Kit均购自美国Invitrogen公司, RNeasy Mini Kit和PCR Purification Kit购自德国Qia- gen公司, MEGAscript T7 Kit 购自美国Ambion公司, WT-ovation Kit购自美国Nugen公司, Picopure RNA Kit及激光显微切割试剂均购自Arcturus公司, Real- time PCR试剂均购自美国ABI公司, 实验所需主要仪 器为Arcturus公司的XT系统激光切割机和ABI公司 的7500型荧光实时定量PCR仪。 1.3 小鼠大脑全皮层RNA的提取 选取8只ICR小鼠, 颈椎脱臼法处死小鼠, 显微 镜下用眼科镊分离得到小鼠大脑全皮层组织, 用 TRIzol方法提取并纯化RNA。 1.4 小鼠第五皮层细胞RNA的提取 小鼠冰冻麻醉后, 在大脑椎体交叉处注射逆行 示踪剂Redbeads, 标记第五皮层细胞。待小鼠存活 两天后处死, 取脑组织包埋, 做冰冻切片, 用激光显 微切割仪捕获标记的第五皮层细胞;