酶催化合成抗病毒核苷类似物磷酸化研究.pdf

第2l卷增刊 分子催化 V01．21，Suppl． JOURNALOF 2007 2007年8月 MOI，ECUI．ARCATAI。YSISfCHINA) Aug． iiiiiiiiiiiiiiin i—— 文童编号：PC-．074 酶催化合成抗病毒核苷类似物磷酸化研究 柴艳倩，何智妍，朱利民‘ (东华大学生物科学与技术研究所，上海201620) 关键词：dCK。核苷类似物，磷酸化 脱氧胞苷激酶(dCK)是人体四大激酶之一， 展的一大方向。目前，大多数核苷类似物的磷酸衍 它是催化抗病毒核苷类药物在人体细胞内磷酸化， 生物都依靠化学合成法合成。但是，化学合成法存 发挥药效的关键酶。但是，在患者体内dCK发生变 在着步骤复杂，反应条件苛刻，副产物多等缺点； 异失活，所以我们利用从小牛胸腺中提取的dCK， 所以，用酶催化合成法来取代化学合成法正日渐成 在体外催化抗病毒核苷类药物的磷酸化，以尝试提 为主流。 高其药效的途径。 由于，大部分的核苷类似物都是dCK的有效底 物，所以可以考虑将dCK用于催化抗病毒核苷类药 1简 介 物的体外单磷酸化反应1HJ。 I．I脱氧胞苷激酶(dCK) 2实验内容 dCK是人体细胞内四大激酶之一。它不但能催 化天然核苷的磷酸化，还能催化核苷类药物在人体 2．1小牛胸腺dCK的分离纯化 细胞内的单磷酸化。大多数抗病毒核苷类药物进入 2．1．1小牛胸腺dCK粗酶的提取利用粉碎匀 人体细胞后，在细胞中的dCK的催化下与磷酸供体 浆、硫酸盐分步盐析、透析的方法从小牛胸腺中提 取dCK粗酶。 (ATP和UTP)结合生成核苷类似物的单磷酸衍生 物，再进一步磷酸化为三磷酸衍生物，抑制病毒的 2．1．2提取小牛胸腺dCK纯酶利用FPLC(快速 逆转录酶，从而阻止病毒的复制，发挥药效。在以 蛋白质层析仪)对小牛胸腺dCK粗酶进行纯化，包 上的过程中，核苷类似物的单磷酸化反应是限速步 括凝胶分子层析和离子交换层析的应用。 骤，是药物发挥作用的关键。有研究表明，在一些 2．1．3小牛胸腺dCK纯酶的表征以CdA为底 患者体细胞内，dCK产生了变异而失活，不能催化 物，ATP为磷酸供体。酶促反应的产物为CdAMP； 核苷类似物的单磷酸化，从而导致了抗病毒药物的 利用HPLC测定反应混合物中CdA减少的量来确 J。 失效1¨。 定riCK的活性15 1．2抗病毒核苷类似物磷酸衍生物的合成： 有研究表明，抗病毒核苷类药物的磷酸衍生物 胸腺dCK纯酶进行表征，所得的dCK分子量约为 67kDa(图1)。 具有更高底物活性和更低的毒性，所以，开发抗病 毒核苷类似物的磷酸衍生物是目前核苷类药物发 ’通讯联系人，上海fIi辩委漓江人才计划资助项目(05PJl4014)． 鬣 嘲 目】经Ⅱ女7女换层**得∞dCK纯酶的电诛表征 基)腺嘌呤的磷酸化反应，一步得到阿德福韦嫂酯 22dCK催化抗病毒