实验六 PCR反应2011.ppt

实验六 PCR反应 一、实验目的 了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。 PCR的过程： 高温变性：将反应体系置于高温下变性，使模板双链DNA解链为两条单链 低温退火：引物与模板链结合，形成部分双链DNA 中温延伸：Taq DNA聚合酶使引物从5′端向3′端延伸，4种dNTP掺入合成新的DNA互补链 反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。 三、实验材料 实验二所提质粒： pET32-CaM5 四、试剂 1. 10x PCR buffer 、rTaq 酶 2. dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM 3. 前向引物(10uM)： 5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3’ 4. 反向引物(10uM)： 5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3’ 5. 1.0% 琼脂糖凝胶 以pET32-CaM5为模板，理论上能扩增出一条443bp的DNA条带 正向引物（Forward primer CaM5-F） EcoRI 5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3’ （与ATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC相同） Tm=64℃ 反向引物（Reverse primer CaM5-R）： NotI 5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3’ （与TTTGTCAAAGTTATGATGGCAAAG互补） Tm=64℃ 五、实验步骤 1、PCR反应混合液的配制 (50μl) 10 x PCR buffer 5μl dNTP mixture 4μl 前向引物 (P1) 2μl 反向引物 (P2) 2μl DNA 模板 1μl rTaq酶 0.5μl 灭菌蒸馏水 35.5μl 所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加20μl矿物油覆盖。 2、PCR仪的参数设置 94℃ 2 min 94 ℃ 30sec 35 cycles 62 ℃ 30sec 72 ℃ 30sec 72 ℃ 5 min 3、琼脂糖凝胶电泳检测 反应结束后，取5μl PCR产品，加入1μl 6或10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min。 其余45μl PCR产品保存在-20℃冰箱中，下次实验使用。 * * ATGGCAGATCAGCTCACCGATGATCAGATCTCTGAGTTCAAGGAAGCTTTTAGCCTTTTCGACAAAGACGGAGATGGTTGCATCACAACGAAAGAGCTAGGAACAGTGATGAGATCATTAGGTCAAAATCCAACAGAAGCAGAGTTACAAGATATGATAAACGAAGTAGATGCTGATGGTAACGGAACCATAGACTTCCCTGAGTTTCTGAACCTAATGGCTAGGAAGATGAAGGACACTGACTCTGAAGAAGAGCTCAAAGAAGCTTTCAGGGTTTTCGATAAGGACCAGAACGGTTTCATCTCGGCAGCTGAGTTAAGACATGTAATGACAAATCTTGGTGAGAAGTTAACTGATGAAGAAGTTGATGAGATGATCAA