4植物脱毒技术教案.ppt

指示植物indicating Plant法 定义:将一些对病毒敏感、症状特征显著的植物作为指示植物(又叫鉴别寄主),利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法. 优点:方法简单\灵敏\准确\擦方便,仍为一种经济有效的方法 缺点:枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能测出相对的感染力 指示植物法 3、电子显微镜鉴定法 小于0.1mm的病毒颗粒 用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有的病毒粒子存在，还可测量病毒颗粒的大小、形状和结构。 较为先进的方法，但需一定的设备和技术 4、抗血清鉴定法 利用抗原与抗体特异反应的特性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类，常用的有沉淀反应法、琼脂扩散法、酶联免疫吸附法。其中酶联免役吸附反应（ELISA）是常用的一种方法。 Elisa技术（enzyme-linked immuno sorbent assay酶联免疫吸附测定） Elisa技术（enzyme-linked immuno sorbent assay酶联免疫吸附测定） ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 特点:特异性高\测定速度快 很常用 抗血清的基本原理是通过植物病毒的抗原与抗体的专化结合, 形成可见反应而加以判断。由于植物病毒抗血清具有高度的专化性, 受体植物无论显、隐症, 无论是何种传播介质, 均可通过抗血清反应法准确判断病毒的存在与否, 进行病毒的快速诊断。 5、分子生物学鉴定1、双链RNA法 通过提取纯纯化待测植物RNA，并对其进行电泳分析，可确定dsRNA存在，从而判断待检植物是否带病毒。2、互补DNA（c DNA）检测法 也叫DNA分子杂交法 五、无病毒种苗的保存、应用及繁殖 （一）无病毒原种的保存 获得无毒原种不易，若保存不好会很快重新感染病毒。为防止再度感染，应在隔离条件下保存。 若原种保存得好，无毒原种可以利用5-10年，在生产上可以创造更多的经济效益。 1、隔离种植保存 通过无毒原种要在隔离区或隔虫网室内种植保存。植物病毒的传播媒介主要是昆虫如蚜虫、叶蝉 2、离体保存 脱毒苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于试管内，可长期保存，是最理想的保存方法。 一、无病毒苗的保存 （一）隔离保存 通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目，即网眼为0.4～0.5mm大小的网纱，也可用盆栽钵。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。另一种更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。 （二）长期保存 1、低温保存 将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，低温下离体保存，是长期保存无病毒苗及其他优良种质的方法。只需半年或一年更换培养基，也叫最小生长法。 2、冷冻保存（超低温保存） 用液氮（-196℃）保存植物材料的方法。常用冷冻保护剂为DMSO（5-8%）、甘油、脯氨酸（10%）、各种可溶性糖、聚乙二醇等。（见十二章） （二）无毒原种的应用 获得无毒原种后，一方面要积极进行无毒苗的推广，另一方面还要做好无病毒种的繁育。 无毒苗的推广应在发展良种的新区使用才能取得良好的效果；在老病区使用时应实行统一的防治措施，一次性全区换种，才能取得应有的效果。 （二）无病毒苗繁育生产体系 我国农作物无病毒苗繁育生产体系归结为以下模式： 国家级（或省级）脱毒中心——无病毒苗繁育基地——无病毒苗栽培示范基地——作物无病毒化生产 香石竹脱毒的操作程序 无毒优质种苗生产程序 （三）无病毒原种的繁殖 可在无毒源和其他病虫害的大田中进行，场地土壤要进行消毒，防治蚜虫、线虫和其他传毒媒介，并建立一套严格的原种繁育制度和栽培管理制度，防止病