实验八 PCR产品化及定向克隆-09级实验八 PCR产品纯化及定向克隆-09级.ppt

实验八 PCR产品纯化及定向克隆 一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的DNA纯化和连接方法；巩固DNA酶切的操作。 二、实验原理 PCR产物一般都含有过量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影响后续的基因操作，利用苯酚/氯仿、氯仿依次抽提反应体系中的酶，然后在酸性条件下用乙醇沉淀DNA。 根据实验六所用的PCR引物，其产品的5′和3′末端分别具有EcoR I和Not I酶切位点，而载体pET32的多克隆位点中也有此两个酶切位点。因此，若将PCR产物与载体分别用EcoR I和Not I进行双酶切，所得的产物相应末端正好互补，可用T4 DNA连接酶在体外进行连接。 三、实验材料与主要试剂 1、实验材料 实验二提取的质粒载体pET32 实验七的PCR产品以及实验八的RT-PCR产品 2、主要试剂 限制性核酸内切酶：EcoR I和Not I T4 DNA连接酶 苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、 无水乙醇、70%乙醇等 四、实验步骤 1、PCR产品的纯化 每组同学的PCR和RT-PCR产品合并，约130μl，转入1.5ml离心管中，向PCR产品中加入150μl苯酚/氯仿/异戊醇，旋涡混合，14000 rpm离心5 min； 将上层水相转移至新离心管，加入150μl氯仿，旋涡混合，14000 rpm离心5 min； 再将上层水相转移至新离心管，加10μl醋酸钠和250μl无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置 30 min； 在4℃下14000 rpm离心10 min，去除上清，观察DNA沉淀。 加20μl灭菌水溶解DNA，备用。 四、实验步骤 2、PCR产品与载体pET32的双酶切 分别在两个1.5mL离心管中准备双酶切反应混合液。 A. 10 × H buffer 5μl B. 10 × H buffer 5μl 0.1% BSA 5μl 0.1% BSA 5μl EcoR Ⅰ 2μl EcoRⅠ 2μl NotⅠ 2μl NotⅠ 2μl PCR产品 20μl pET32载体 约2μg 灭菌蒸馏水 16μl 加灭菌蒸馏水至总体积50μl 四、实验步骤 3、酶切产品的纯化 酶切后的PCR产品和载体合并 (约100μl )，加入100μl苯酚/氯仿/异戊醇，旋涡混合，14000 rpm离心5 min； 将上层水相转移至新离心管，加入100μl氯仿，旋涡混合，14000 rpm离心5 min； 再将上层水相转移至新离心管，加10μl醋酸钠和250μl无水乙醇，混匀后，离心管插入冰中放置 30 min； 在4℃下14000 rpm离心10 min，去除上清； 加入500μl 70%乙醇洗涤DNA沉淀，在4℃下14000 rpm离心5min，去除上清，空气干燥； 加8μl灭菌水溶解DNA，备用。 四、实验步骤 4、目的基因(CaM5)与载体(pET32)的连接 在灭菌的PCR管中依次加入： 10 × T4 DNA Ligase buffer 1μl T4 DNA Ligase 1μl PCR产品和pET32 8μl 五、实验结果 本实验结果必须通过观察转化后所得菌落的多少来判断连接的效率。 * * 正向引物（P1） EcoRI 5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3’ 反向引物（P2）： Not I 5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3’ 将上述两个离心管内的混合物轻轻混匀，37℃水浴酶切3小时。 将混合物轻轻混匀，16℃连接过夜。 第二天，