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多菌灵降解菌的降解特性及GFP标记 【摘要】：多菌灵(carbendazim，MBC)，化学名称为N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯，是一种高效广谱低毒的内吸性杀菌剂，属于苯胺类苯并咪唑衍生物，其使用范围较广，既可作为工业杀菌剂，又可作为一种有内吸活性的植物杀菌剂，用于水果保鲜、蔬菜、果树和谷类作物的病害防治。多菌灵化学性质稳定，在土壤中降解半衰期较长，能持久地残留在使用部位，易致累积效应，其在水体和土壤中的累积会对生态环境和人类健康造成威胁。有研究表明，微生物降解是沉积环境中多菌灵去除的主要途径。因此寻找并研究多菌灵降解菌是十分必要的。山西省农药重点实验室已分离筛选出一株细菌NY97-1，经试验证明该菌具有降解多菌灵的特性，若能进一步研究其降解能力、降解条件，为其在生物修复中的应用提供依据和实验材料，无疑具有重要的理论和现实意义。绿色荧光蛋白(GFP)基因作为标记基因，被广泛应用于环境微生物学方面，由于其表达稳定，容易观测，因此，可以以GFP作为报告基因，对菌株NY97-1进行GFP标记，为今后研究多菌灵降解菌在自然环境中的定殖、分布及动态变化打下基础。本文的主要研究内容有如下几个方面：1．该菌株NY97-1的16SrDNA经同源序列比对，同源性为99％以上，结合生理生化指标鉴定其属于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。2．经BamHI酶切的启动子探针载体pUC19-gfp与NY97-1基因组DNA的Sau3AI酶切片段酶连，酶连产物转化E．coliDH5a，建立B．p的启动子基因文库。挑选其中的两个强阳性克隆，亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组的启动子活性片段F4、F5，构建大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pNW33N-GFP4、pNW33N-GFP5。通过电转化得到gfp在B．p中的两株标记菌株。在荧光显微镜下，观察到了明亮的绿色荧光，证明活性片段F4、F5均具有组成型启动子的功能，实现了GFP基因在B．p中组成型表达，且遗传稳定，为今后研究多菌灵降解菌B．p在自然环境中的定殖、分布及动态变化打下了基础。3．本文研究并建立了多菌灵在降解培养基中的残留检测方法。该方法采用甲醇和水溶液的混合液作提取剂，检测结果表明：该方法的准确度、精密度和灵敏度等指标均符合农药残留分析的基本要求，同以往所报道的方法相比具有样品前处理过程相对简单，回收率高，重复性好，且费用较低等特点，适合于该降解菌的降解能力的检测。4．本文对多菌灵降解菌株NY97-1的降解性能进行了研究。结果表明：该菌株对多菌灵有较强的降解能力。细菌菌株NY97-1在多菌灵浓度为100mg·L~(-1)的条件下，30振荡培养24h，多菌灵的降解率达78.66％。外界条件对降解菌的降解也有显著影响。培养基初始pH在6～10的范围内均可以高效降解多菌灵，pH为4时，对降解起较大的抑制作用。在多菌灵的浓度为10～300mg·L~(-1)时，菌株NY97-1对多菌灵的降解率为42.44％～90.07％。在35～40时对农药降解率最高，经高温高压处理后的菌液对多菌灵仍有降解作用，说明对降解起主要作用的物质耐热性好。共存底物有机氮可以促进菌株NY97-1的降解能力，而无机氮源尿素对菌株NY97-1的降解能力起抑制作用。5．实验证明菌株NY97-1是一株多功能菌株，不仅具有降解多菌灵的功效，而且对多种枯萎菌具有拮抗效果。对番茄枯萎菌(Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.Lycopersici(Sacc.)SnyderetHansen)、青椒枯萎菌(Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.vasinfectum(Snyd.etHans))、西瓜枯萎菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum(E.F.Smith)SnyderetHansen)、仙客来枯萎菌(Fusariumsp)、一品红枯萎菌(Fusariumsp)、黄瓜枯萎菌(Fusariumoxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinumOwen)的抑制率分别为50.8％，50.8％，54.1％，37.5％，31.6％，42.5％。6．多菌灵单剂对供试的六种枯萎菌菌丝生长具有明显的抑制效果，但10％的NY97-1活体菌液与多菌灵混配会降低多菌灵的毒力，表现为混配剂3d及7d时EC_(50)均比多菌灵单剂的EC_(50)大。这表明NY97-1与多菌灵共存时主要表现其降解作用。该结果对指导NY97-1的合理使用有重要意义。尽管其具有生防与降解双重功效，但在实际应用中仍以降解环境中残留的多菌灵进行生物修复为主。7．研究了多菌灵处理土壤的盆栽黄瓜子叶期及开花期不同器官中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、ATP酶活性的变