山羊脊柱横突间植骨中生物工程骨研究(共3171字).docVIP

山羊脊柱横突间植骨中生物工程骨研究(共3171字) 1材料与方法 1．1材料 实验动物：断奶后（2~6个月）的关中奶山羊，均由西北农林科技大学提供。主要试剂：胎牛血清、分离液、胰蛋白酶、EDTA、地塞米松、β-甘油磷酸钠等试剂盒以及抗体均购于武汉博士德公司，其他试剂为国产分析提纯。 1．2实验方法 1．2.1动物模型选取选用断奶后的关中奶山羊12只，雌雄不限，采用随机区组设计的方法将实验动物分成2组。1．2.2原代BMSCs的提取与培养选取断奶的关中奶山羊，骨髓的抽取和MSCs的分离、培养按照马勇江的方法进行。 1．2.3细胞鉴定取培养第2代细胞，首先用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用PBS（磷酸盐缓冲液）调整细胞浓度至1×107个/ml，细胞鉴定采用CD34-FITC、CD90-PE、CD14-perCP、CD54-APC对细胞标记，置4℃避光孵育30min以上，采用PBS洗1次，应用流式细胞仪进行表面抗原检测。 1．2.4细胞诱导取第2代细胞移入HG-DMEM液进行培养诱导。 1．2.5矿化诱导鉴定采用碱性磷酸酶染色鉴定。 1．2.6腺病毒介导的VEGF转染选择生长良好的传代细胞，待其生长至70%汇合时，用AdVEGF165转染（感染倍数为50∶1），设置对照组（只加DMEM）。2组终末体积用含10%新生牛血清DMEM调至5ml，24h后，换液加入含10%新生牛血清DMEM10ml中，于37℃、5%的CO2条件下培养。分别于第1、3、5、7、9、11、13和15d收获上清,离心后-70℃保存。上清标本统一用VEGFELISA试剂盒检测VEGF浓度。 1．2.7复合物培育将环氧乙烷消毒备用的大小为30mm×5mm×5mm的珊瑚羟基磷灰石仿生人工骨分别放置于6个培养皿中，每皿分别加入浓度为2×106个/ml的已转染成功的MSCs，然后放入5％的CO2、37℃孵箱中培养，每天观察细胞在材料上及周边的生长情况，并照相记录。隔天换液，培养3d，备用。 1．2.8手术方法全身麻醉取俯卧位，备皮，采用2%碘伏消毒术区，沿双侧腰背筋膜纵向切开，分离最长肌和多裂肌，显露双侧L5、6棘突，去除部分皮质骨后彻底止血，然后按照分组的不同于双侧横突间各自植入基因增强人工骨骨条和自体骨条，肌肉覆盖固定，最后逐层缝合切口并包扎。于术前、术中、术后各用青霉素20×104U肌注，植入后1～3d每日20×104U青霉素肌注，植入后分栏饲养，不限活动。 1．2.9手法触诊检查植入物硬度，轻柔检测L5、6活动度，无活动判定为融合，有活动判定为不融合。 1．2.10影像学检测术后4、8、12周每只山羊拍摄前后位X线片，观察植骨处骨小梁长入情况。有连续骨小梁长入的判定为融合，其他情况为不融合。 1．2.11组织学检测12周后将动物处死，取出植入物，福尔马林固定24h，环锯水平修整后脱水，甲基丙烯酸轻乙基酯（GMA）和甲基丙烯酸丁酯（BMA）混合液浸透后包埋、切片，厚度为5μm。切片行HE染色，观察。 1．2.12生物力学检测处死动物后取受力方向的骨块，大小为4mm×4mm×3mm，用材料试验机测试，加载速度为2mm/min。采用点压技术和直径2mm的圆柱形压头，计算压穿软骨下骨板时的压缩强度（从开始加载的基点至断裂点峰值之间的压力与压头面积的比值），在应力应变曲线上计量其弹性模量。 1．3统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，定量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用方差分析，以Plt;0.05为差异有统计学意义。 2结果 2．1细胞鉴定结果 刚接种的细胞为球形悬浮在胞液之中，混有少量的血细胞，4~5d后换细胞液，可见大量单核细胞呈圆形，未完全贴壁；8~10d后换细胞液，可见单核细胞完全贴壁，变成梭形及多角形，12d后大量单核细胞连接成片，形成纤维样细胞集落，15~20d后细胞逐渐汇集，多呈长梭形及多角形，流式细胞仪检测CD90和CD54为阳性，CD34和CD14为阴性，符合骨髓间充质干细胞表面抗原特征。 2．2成骨细胞诱导鉴定 12～14d基质矿盐形成钙化结节，碱性磷酸酶染色可见胞浆被染成棕黑色，并有黑色颗粒沉积，说明培养形成的细胞具有成骨细胞的特性，具有体外成骨的能力（此种细胞含量超过80%）。 2．3VEGF转染结果 结果显示转染组细胞培养上清液中VEGF分泌显著高于未转染组（Plt;0.01），分泌高峰在7～9d，此后逐渐下降，15d仍然可检测到，且依然高于对照组。 2．4手法触诊 所有实验动物均存活且未见异常反应，4周后均有活动度，8周后CHA-MSCs-