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实验三 凝胶过滤法使蛋白质脱盐 山东师范大学生命科学学院 【器材与试剂】 （一）器材 1. 层析柱 (15mm×300mm） 2. 铁架台 3. 滴定管夹 4. SephadexG－25 5. 刻度吸管 （二）试剂 1. 样品溶液 蛋白质－硫酸铵溶液 2.10％黄柳酸 3.钠氏试剂 4.洗脱液（去离子水） * * 生物化学实验之－－ Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 【实验原理】 凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行分离和纯化。 该方法广泛用于生物大分子的分离、纯化、浓缩等。 【实验目的】 学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原理与操作技术 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同的排阻效应实现的。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它具有三维空间的多孔网状结构，呈珠状颗粒。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 本实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的(NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质样品脱盐的目的。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 凝胶过滤层析过程示意图 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 【实验操作】 （一）凝胶的溶胀 取Sephadex G－25， 加入去离子水置室温溶胀 24小时 以上，反复倾 泻去掉细颗粒， 或沸水浴中煮沸 2～3小时，可去 除颗粒内部的空 气及灭菌。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. （二）连接层析装置 1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 按下图将各部位连接起来。 洗 脱 液 连 接 软 管 层