基于BioMEMS技术的DNA固相萃取芯片的制备.pdfVIP

第34卷 2006年3月 分析化学(FENXI HUAXUE) 仪器装置与实验技术 CHnese Journal of Analytical Chemistry 第3期 433—436 基于BioMEMS技术的DNA固相萃取芯片的制备 陈 兴 崔大付。 刘长春 蔡浩原 (中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室，北京100080) ● 摘要基于BioMEMS技术，制备～种新型的Si．PDMS-玻璃结构的DNA固相萃取微流控芯片。在硅基片上 制备4种固相载体，分析不同载体的性质和制各特点，优选多孔氧化硅作为萃取DNA的周相载体。对比研究 芯片的封装工艺，优选压制法制备PDMS-玻璃盖片，采用粘接技术封装芯片。芯片成功提取老鼠全血中的基 因组DNA，提取效率为23．5×10q g／灿全血，并成功进行PCR反应，达到试剂盒水平。固相萃取微流控芯 片具有与其他样品处理芯片、PCR芯片和电泳芯片相集成的潜力，可实现对复杂生物样品的检测和分析。 关键词BioMEMS技术，固相萃取，微流控芯片，封装技术，多孔氧化硅 1 引 言 随着微电子机械系统(MEMS)技术与生命科学和分析科学等学科的交叉深入研究，BioMEMS技术 以及基于BioMEMS技术的微全分析系统(—AS)得到迅速发展。在DNA分析和疾病检测中，高质量和 足够量的DNA是进行PCR反应、电泳、分离、杂交等检测的前提。但目前DNA扩增、杂交和分离等微 流控芯片的研究较多u《J，而DNA提取微流控芯片的研究较少。因此，对DNA提取芯片的研究已成为 微流控芯片集成化和自动化的关键。基于固相萃取法(SPE)的DNA提取法不但能较好的避免DNA降 解，也易于与其他功能芯片相集成。Tian等蹲1将硅微珠填充在毛细管内，硅微珠作为固相载体成功提 取DNA，实现了SPE法的小型化。Breadmore等?利用Sol—gel把硅珠固定填充到微沟道中，实现从血 液、细菌和病毒样品中提纯DNA。载体填充法具有灵活更换载体的优点，但填充操作复杂，也不易控 制。Cady[81和Christel【91报道了硅微柱阵列式DNA提取微流控芯片，硅微柱作为载体提取DNA，不需填 充载体，但制备工艺要求较高。此外，芯片封装也制约着微流控芯片的发展。已报道SPE芯片H。1采 用硅．玻璃阳极键合实现芯片封装，密封性好，不易漏液，但设备昂贵，键合费时。本实验从固相载体的 选择和芯片封装技术的改进展开研究，通过提取全血DNA评价SPE芯片的性能。 2实验部分 2．1仪器与试剂 AMSl00 SE型深刻蚀机(法国Adixen公司)；SB6键合机(德国Karl SUSS公司)；ASM型PCVD炉 (美国ASM公司)；MA6型曝光机(德国Karl SUSS公司)；Alpha—step 500型台阶仪(美国Tencor公司)。 实验所用外周血均取自普通小鼠，肝素抗凝。Sylgard 184型PDMS前体和固化剂购自美国Dow Coming 公司；A—DNA，盐酸胍(Guanidine hydrochloride，GuHCI)和Triton X．100试剂购自北京欣经科生物技术有 限公司；SYBR Green—I核酸荧光染料购自BioWhittaker Molecular Applications(Rockland．Me U．S．A)； PCR反应试剂盒和DNA提取试剂盒购自北京天为时代科技有限公司。引物5’．AGAAGTACCTGCAA— CAGG-37和5-GACGGACACATrGGGGGT-3’由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。配制IX缓 冲液(10 mmol／LIris—HCl，1 retool／L EDTA-2Na，pH 8)。所用试剂均为分析纯。 2005-08-29收稿；2005-lO-3l接受 本文系国家自然科学基金重大项目资助(No60427001、6051020) 万方数据 分析化学 第34卷 2．2芯片制备 2．2．1硅基片制备不同固相载体的制备工艺略有不同。V形沟道制备过程如下：清洗硅片，沉积氮 化硅；光刻，包括甩胶(1500 r／min)、前烘(80。C，lh)、曝光(23 s)、显影(0．6％NaOH，1 min)和坚膜 (1200C，l h)；然后把光刻图形转移到氮化硅层；各相异性湿法腐蚀(33％的KOH，70℃，3—5 h)得V形 沟道；1050℃氧化3 h；去掉掩膜氮化硅。矩形沟道和硅微柱是采用深刻蚀技术干法刻蚀而成，Al为深 刻蚀掩膜。多孔硅是采用电化学腐蚀技术腐蚀V形沟道而成(电流密度50 mA／cm2，电解液浓度48％ HF：96％乙醇(1：4，V／V)，腐蚀时间10 min)，氮化硅为电化学腐蚀掩膜，然后500℃氧化1 h。 2．2．2芯片封装硅一PDMS