第10章化学发光免疫试验范例.pptxVIP

临床免疫学检验技术 第十章 化学发光免疫试验 张国军 目 录 第一节 概述 第二节 化学发光剂的特征 第三节 化学发光免疫试验的类型 第四节 化学发光免疫试验的临床应用 第五节 临床常用化学发光免疫试验试剂方法特点 第六节 影响化学发光免疫试验的主要因素 第一节 概 述 重点提示 发光 化学发光 化学发光的条件 化学发光的效率 化学发光免疫试验的分类 化学发光免疫试验的非均相分离方式 一、发光的分类 发光：是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: 光照发光、生物发光、化学发光。 光照发光是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，跃迁到激发态，当其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。 生物发光是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。 化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象，由于化学反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量产生光子，从而导致的发光现象。 二、化学发光产生的条件 一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A + B→C* C*→C + hγ 若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A + B→C* C* + D→C + D* D*→D + hγ 无论直接化学发光还是间接发光，一个化学反应要产生发光现象，必须满足以下条件: 1.该反应必须提供足够的激发能，并由某一步骤单独提供，因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光。 2.要有有利的反应过程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。 3.激发态分子必须具有一定的化学发光效率释放出光子，或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。 三、化学发光效率 化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率（φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。 四、化学发光免疫试验的分类 化学发光免疫分析，根据待测分子的大小可设计成多种反应模式，如夹心法、竞争法等。 根据游离标志物和结合标志物是否需要分离，可分为均相和非均相测定两种。 根据化学发光试验中标志物的不同及反应原理的不同，大体可分为四种类型：直接化学发光免疫试验、化学发光酶免疫试验、电化学发光免疫试验、发光氧通道免疫试验。 五、化学发光免疫试验的非均相分离方式 为实现游离标记物和免疫复合物标记物的分离，各系统采用的方法各有不同，主要采用固相、过滤、珠式、顺磁性颗粒分离等方式 第二节 化学发光剂的特性 重点提示 直接化学发光剂 电化学发光剂 酶促反应发光剂 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体，常用的为吖啶酯。 三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。 酶促反应发光剂是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。常用的有鲁米诺及其衍生物和AMPPD。 化学发光剂的发光原理详见第四章。 第三节 化学发光免疫试验的类型 重点提示 直接化学发光免疫试验 电化学发光免疫试验 发光氧通道免疫试验 一、直接化学发光免疫试验 原理：用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。 直接化学发光的原理-双抗体夹心法 二、电化学发光免疫试验 原理：磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，待测标本与相应的抗原 (抗体)发生免疫反应，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室