聚合本酶鏈式反应PCR技术讲座.pptVIP

TaqMan探针 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq酶 Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 反应体系 变 性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Taq l 5’ 3’ R Q Probe 5’ 3’ R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ R Q 退 火 5’ 3’ 1. 链取代 Taq 3’ Q R 5’ 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ 2. 水 解 3. 聚 合 5’ 3’ Q Taq R 3’ 5’ 4. 检测荧光 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ l TaqMan探针的设计原则 Tm大于引物Tm10℃ 5’末端不能是G 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq酶 Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 反应组分 分子信标(Molecular Beacons) 变 性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Taq 5’ 3’ R Q R Q Molecular Beacon 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 1. 链替换 Taq 5’ 2. 聚合完成 l 5’ 3’ R Q 退 火 5’ 3’ R Q 5’ 3’ 3’ 5’ Taq R Q Molecular Beacon FRET 探针 5’ 3’ 5’ 3’ l 3’ D R 5’ 退 火 5’ 3’ 链替换,荧光熄灭 5’ 3’ 3’ 5’ Taq 3’ D R 1-5 bases D R Taq 5’ R 5’ Texas Red, ROX CY3.5, Redmond Red 常用的荧光基团 FAM TET, VIC CY5 CY5.5, LC705 LC640 HEX JOE CY3 TAMRA Absorbance (nm) Emission (nm) 552 570 643 667 494 525 535 556 521 520 536 548 565 580 583 603 5’ 3’ F Q Tubulin 5’ 3’ H Q GapdH 5’ 3’ TX Q b-actin 5’ 3’ Cy5 Q Cyclophilin 多色荧光检测技术 ——同时检测4色荧光 3、荧光定量PCR的应用 相对定量：基因在不同组织中的表达差异、药物疗效考核 绝对定量：基因表达研究、病原体检测、转基因食品检测 相对定量 参考基因：Actin, GAPDH, 18sRNA 1.3 20.8 22.1 实验组 5.7 19.5 25.2 对照组 ΔCt GAPDH 靶基因A 1．计算ΔCt：ΔCt=Ct 靶基因－Ct GAPDH，分别计算实验组和对照组的ΔCt。 2．计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，本例中ΔΔCt= －4.4。 3．计算相对表达量的差值。2 －ΔΔCt 绝对定量 构建标准曲线： A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。 B、利用纯化的扩增产物制备 C、克隆有扩增产物的质粒 标准品的选择： 标准品可以从厂家购买，也可以自己制备 标准品的单位，取决于对最终结果的要求：拷贝数，%，ng/uL, mol/uL（如：如果要得出的是样品中的基因拷贝数，则梯度稀释已知摩尔浓度的DNA）  荧光强度的校正 影响荧光信号强度的因素包括： 光源强度、管盖透光性能 缓冲液用量、反应体积、PCR反应强度等等 以扩增前的荧光探针本底信号为依据，荧光强度归一化校正。 内参照荧光Rox校正。 PCR扩增效率的校正 利用多色荧光检测技术对内标荧光的检测可校正PCR扩增效率误差。 实验误差校正技术——准确定量 1、隔离操作、戴不受污染的手套 2、试剂的配制、分装和保存 3、开盖前先离心，小心开盖和上盖。 4、加样时最后加模板DNA 5、设立对照实验 6、注意其他操作过程中可能造成的污染 七、防止PCR错误扩增的措施 八、PCR常见问题及解决办法 （一）扩增不出特异性带 1、原因 （1）引物设计有问题（引物位置错误，引物之间太强的相互作用） （2）反应体系有问题 （3）退火温度太高 2、解决办法 （1）确认引物正确性 （2）用保证能扩增出来的引物验证反应体系 （3）采用梯度PCR功能，寻找最适合的退火温度 （二）扩增带很弱 1、原因 （1）反应体系效率低 （2）退火温度太高