石蜡切片步骤.docVIP

石蜡切片步骤 取材 按照需要取材，材料体积限制在0.6cm x 0.4cm x 0.3cm，便于溶液渗入。切取材料要迅速,切口尽量平整。 固定与脱水 常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。用F.A.A固定液固定，时间至少24小时。F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。 脱水的目的是除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包埋等步骤的进行，因为这些程序中所用的药品都不能与水混合，所以必须脱水。 将材料置于玻璃小瓶，加入以下各溶液，溶液体积需为材料总体积的20倍以上。以下为FAA固定法。 幼嫩材料： 材料浸入50%乙醇的FAA，4℃真空抽气30min； 4℃过夜； 50%乙醇清洗30分钟，换新50%乙醇重复一次； 70%乙醇浸1－2小时，85%乙醇浸1－2小时，95%乙醇浸1－2小时，100%乙醇浸1－2小时，换新100%乙醇浸1－2小时。 非幼嫩材料： 材料浸入70%乙醇的FAA，4℃真空抽气30min； 4℃过夜； 70%乙醇清洗30分钟，换新70%乙醇重复一次； 85%乙醇浸1－2小时，95%乙醇浸1－2小时，100%乙醇浸1－2小时，换新100%乙醇浸1－2小时。 如后续步骤为原位杂交，强烈建议用含4%多聚甲醛的PBS（不含戊二醛）做为固定液固定过夜，然后从30%的乙醇溶液开始，同上所述逐步过渡到100%乙醇。 用95%酒精配制各浓度酒精的方法：设原有酒精浓度为A，所需配制酒精浓度为B，则取Bml原有酒精，加上A-Bml蒸馏水，即可获得Aml的B%的究竟。例如：95%酒精配成70%的酒精，则取70ml的95%酒精，加上25ml蒸馏水，则配成了95ml的70%的酒精。 透明与浸蜡 透明的目的是将脱水剂从材料中除去，使材料透明，增加折光系数；同时便于下步的浸蜡和包埋等程序（因为究竟不能溶解石蜡）。 透明剂是一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的药剂。常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也是逐级进行，可减少材料收缩。 材料依次转入不同浓度的氯仿和乙醇混合溶液，其中氯仿分别占1/5、2/5、3/5、4/5和纯氯仿，然后浸蜡。具体如下： 在氯仿占1/5的溶液中浸3－4小时，在氯仿2/5的溶液中浸3－4小时，在氯仿占3/5的溶液中过夜； 在氯仿占4/5的溶液中浸3－4小时，在纯氯仿中浸3小时，换新氯仿浸3小时； 用刀片削入碎蜡屑至饱和，分2次加入，先少后多，每次加入后，置38－40℃温箱融化。 浸蜡时材料不要太多，瓶塞不要太紧。 一般所用的石蜡分软蜡（熔点40℃ 以下）和硬蜡（熔点40℃以上）。浸蜡过程一般是从低温到高温、从低熔点到高熔点逐渐进行，这一过程不能操之过急，否则浸蜡不彻底影响切片。此外，软材料可用熔点较低石蜡，较硬的材料可用熔点较高的石蜡；冬季可用熔点较低的石蜡，夏季可用熔点较高的石蜡。石蜡必须纯净，不含杂质。整个浸蜡过程需在恒温箱内进行（按需要调整温度）。材料最后一次二甲苯透明后即可浸蜡，浸蜡过程中逐渐使二甲苯挥发，并不断加入纯石蜡，直至石蜡饱和为止。浸蜡时间大约1~2天。 包埋 准备工作： 1）配25%，50%，75%，100%①，100%②，100%③，100%④共7级石蜡。100%①-③均为纯石蜡。100％④改为9份石蜡加1份蜂蜡，熔解摇匀，过滤至杯中，用来包埋（需配2杯）。7杯均需在杯身和杯盖标清名称。 配法例如：25%石蜡即称取40g石蜡熔解，再加入120ml二甲苯（通风橱内进行），摇匀后，用三层纱布过滤至瓷杯中（前六级石蜡按照反顺序配制和过滤）。 2）做材料盒。1.5cm*1.5cm*2.5cm大小，底部用针戳较多小孔（孔径需小于材料），上面要有提绳，挂一个回曲针，纸盒不能用胶水粘合，用牛皮纸。几种材料就需几个纸盒。 3）做包埋纸盒。6cm*3cm*2cm大小，纸盒不能用胶水粘合，用牛皮纸，盒底一角用铅笔粗写材料号，号码反着写。几种材料至少需要几种纸盒。 步骤： 1．37℃熔化小瓶中物质，镊取材料至各材料盒。将纸盒缓缓浸一半至梯度石蜡中让回曲针挂在石蜡杯外，吊住盒子。每级石蜡浸置1小时，25％那一级只需0.5小时。25％石蜡需42度，50％和75%石蜡需52度，100％石蜡需57度。每次换时，要等蜡从材料盒底部小孔滴尽后再转入下一杯； 2．在包埋纸盒下垫一片载玻片，再盛入一半多体积的100%④石蜡。倒掉材料盒中的石蜡，夹取未凝的材料摆入包埋盒中，可横二行，纵三行。每堆材料面积不能太大，堆与堆之间要隔开一些，防止切割时弄碎； 3．包埋盒内石蜡表面凝后，连玻片一起放