流式细胞术实验方法及应用讲述.ppt

全血或单细胞+刺激素(佛波脂)和阻断剂(莫能霉素) 37℃培养4-6h 加入细胞表面抗体(如CD3、CD4/CD8) 孵育20-30min PBS洗1次 加固定破膜剂 室温15min 加入IFN- r和IL-4抗体 孵育30min PBS洗两次 FCM。 结果分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（FS）和侧向散射（SS）圈出淋巴细胞，再用CD3+和SSC设门圈出T淋巴细胞，再用CD8-/CD3+设门选定T淋巴细胞亚群，再分析IL-4+和CD4+/IFN-r 淋巴细胞 T淋巴细胞（CD3+） CD3+CD8- （CD4+） IFN-r IL-4 检测 Fluo-3/Am是高特异性Ca2+荧光指示剂，能与Ca2+特异结合。Fluo-3它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去AM重新生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离Ca2+浓度的变化。 单细胞悬液+flour-3/AM 37oC避光孵育40min PBS洗1次 上机检测 线粒体膜电位（MMP）是线粒体功能的重要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直接反映线粒体功能及数量，MMP下降，其氧化磷酸化功能障碍，使ATP产生减少，导致细胞凋亡和坏死。 　　Rhodamine123（罗丹明123）、DiOC6、JC-1等多种亲脂性的阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作为检测 MMP的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，线粒体内膜的内侧带负电荷，当它们与活细胞一起培养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。 当MMP降低后，线粒体内的荧光素会发生外漏，在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能反映线粒体数量和MMP的降低或丧失。 操作：单细胞悬液（1*10 6 ）+1umol/L的Rh123 37 oC,30min PBS洗两次 上机检测 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序结束其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。 　　半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以无活性的酶原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的片段。活化的Caspase进一步激活其他的Caspase前体，形成了级联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目前已发现15个Caspase家族成员，分别命名为Caspase1-15。在Caspase家族成员中，Caspase-3是最重要的指示蛋白酶。 操作： 单细胞悬液（1*10 6） 固定和破膜剂 冰浴20min Perm/Wash Buffer洗两次 20ul单抗 室温孵育30min Perm/Wash Buffer洗1次 加0.5ml Perm/Wash Buffer 上机检测。 　　　细胞凋亡过程中有多种基因蛋白参与调控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、 ced基因家族等。 抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad 等 促凋亡基因:bax、bak、bcl-XS等 染色标记同Caspase Fas又称APO-1，即CD95分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡受体。Fas/FasL是凋亡诱导家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重要分子,Fas/FasL结合,可向细胞传递死亡信号,引起细胞凋亡。 检测：同表面标记 被认为比较成熟的方法： 　 PI单染色法 Annexin V／PI双染法。 TUNEL法 碘化丙啶（PI）单染法（DNA周期分析）： 　　　由于凋亡细胞DNA被降解，小分子DNA可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分DNA，造成凋亡细胞DNA含量减少，与荧光染料结合减少，荧光强度减弱，在DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。 　 Annexin V／PI双染法： 　　　在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征，PS被