Calcein-AM荧光扫描测定细胞毒方法的建立.pdfVIP

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００-４８４Ｘ．２０１４．１０．０１４ · 免疫学技术与方法· Calcein-AM荧光扫描测定细胞毒方法的建立① 陶嫦立 丁哲纯 郭雯静 吴凤麟 邵红伟 黄树林 （广东药学院生命科学与生物制药学院／广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广州 ５１０００６） 中图分类号 R392畅33 文献标志码 A 文章编号 1000-484X（2014）10-1364-05 ①本文为国家自然科学基金、国家重大科技专项“重大 新药发展”（２００９ＺＸ０９１０３-７０８）项目资助。 作者简介：陶嫦立（１９８０ 年－），女，讲师，主要从事基因免疫治疗方 面的研究，Ｅ-ｍａｉｌ： ｔａｏｃｈａｎｇｌｉ＠１２６．ｃｏｍ。 通讯作者及指导教师：黄树林（１９５３ 年－），男，教授，博士生导师，主 要从事基因免疫治疗及 Ｔ 细胞受体的研究， Ｅ-ｍａｉｌ：ｓｈｕｌｈｕａｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。 ［摘 要］ 目的：建立和优化基于钙黄绿素-ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ）荧光扫描的细胞毒测定方法。 方法：首先使用 Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ 染色靶细胞，扫描检测 Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ荧光值，确定 Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ最佳激发波长和发射波长；然后优化 Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ染色的浓度和时 间；最后以效靶比为 ３０∶１ ～１∶１，共孵育时间为 ４ ｈ，荧光扫描测定靶细胞裂解的百分率。 结果：荧光染料 Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ能有效标 记靶细胞，最佳激发波长和发射波长为 ４８５ ｎｍ和 ５１５ ｎｍ；Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ对细胞毒性低，不影响细胞活性；４ ｈ内的自发释放率低 于 １５％；ＣＩＫ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ）效应细胞与靶细胞共孵育 ４ ｈ的细胞毒效应随效靶比增加而升高。 结论：建立和优化了 Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ荧光染料标记靶细胞检测细胞毒效应的方法，该方法可避免放射性试剂的应用，对细胞毒性低，准确性高。 ［关键词］ Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ； 细胞毒； 荧光释放测定 Development of a novel assay for cytotoxicity test by Calcein-AM release TAO Chang-Li，DING Zhe-Chun，GUO Wen-Jing，WU Feng-Lin， SHAO Hong-Wei，HUANG Shu-Lin畅Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidates，School of Biosciences and Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou ５１０００６，China ［Abstract ］ Objective： Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂａｓｅｄ Ｃａｌｃｅｉｎ -ＡＭ ｒｅｌｅａｓｅ畅Methods： Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ ｄｙｅ，ｔｈｅｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ａｔ Ｅ ／Ｔ ｒａｔｉｏｓ ｆｒｏｍ ３０∶１－１∶１ ｆｏｒ ４ ｈ ａｔ ３７℃，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ -Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ畅Results： Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈｓ ｏｆ Ｃａｌｃｅｉｎ ｗｅｒｅ ４８５ ｎｍ ａｎｄ ５１５ ｎｍ畅Ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ ｈａｄ ａ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｖａｌｕｅｓ畅Ｔｈｅ Ｃａｌｃｅｉｎ-ＡＭ ｄｙｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔａｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｔｏ ｈａｖｅ ａ ｌｏｗ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｌｅａｋａｇｅ ｒａｔｅ-ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １５％ ｉｎ ４ ｈｏｕｒｓ ａｔ ３７℃畅Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＩＫ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅ／Ｔ ｒａｔｉｏ ｗｈｅｎ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ａｔ ４ ｈ畅C