2012CB966300-G理念.docVIP

项目名称： 神经分化各阶段细胞命运决定的调控网络研究及其转化应用 章小清 同济大学 2012.1至2016.8 上海市科委 教育部  （一）拟解决的关键科学问题以下： 人类细胞））） 回答这些关键科学问题的核心是通过横向和纵向的比较，结合胚胎标本提炼神经分化发育各阶段，包括神经外胚层细胞、部位特异性多潜能神经前体细胞及成熟的神经细胞的信号网络和转录因子网络。并进一步通过调控这些分子网络，建立高效生成特定类型神经元或胶质细胞的技术方法。在此基础上和特定疾病状态结合，研究这些神经细胞的功能活性及其在中枢神经系统疾病治疗中的实际意义。 （二）主要研究内容以下个课题；；→神经外胚层细胞→多潜能神经前体细胞→神经元或胶质细胞逐步分化的过程中，除了这些关键信号的作用外，转录因子也在其中起了决定性作用。然而目前我们对哪些转录因子在这些过程中起关键作用，及其具体的分子机制仍然了解的较少，研究最为透彻的还是以Oct4/Sox2/Nanog为核心的转录网络在早期的多能干细胞自我更新中的关键作用。还有一点必须提及的是神经定向分化的过程，同时也是各类型神经干细胞分化潜能逐步下降的过程。神经外胚层细胞能分化为神经系统的各种细胞类型，而区域化后的神经前体细胞只能分化为神经系统某一特定部位的神经元和胶质细胞。在此，我们拟设立课题1，2，3 分别就神经分化各关键步骤的分子机制进行深入探讨，同时通过课题4 将这些基础研究向实际应用进行转化。 神经外胚层细胞命运决定的分子网络研究 有关神经外胚层发育的研究在上世纪20年代就开始了。当时通过在蛙卵中进行细胞移植实验，发现蛙卵中一些特定部位的细胞能诱导外胚层细胞（类似于哺乳动物中的多能干细胞）发育为神经组织。其后几十年的研究发现，这些细胞分泌Noggin等BMP信号抑制因子，从而促进神经外胚层的生成。这就为后来形成著名的“Default”神经诱导学说奠定了基础，即外胚层细胞在没有外来信号作用的情况下倾向于发育为神经外胚层，Noggin就是通过抑制BMP信号而发挥神经诱导的作用。但是越来越多的实验也证实，神经诱导可能是一个较为复杂的过程，除了抑制BMP信号外，激活FGF信号及抑制Wnt信号可能也在其中发挥重要作用。由于哺乳动物的胚胎发育在子宫内进行，因而对哺乳动物胚胎发育分子调控机制的研究要困难的多。虽然小鼠转基因研究从某些侧面证实了抑制BMP、激活FGF信号在小鼠神经外胚层细胞发育的过程中起重要作用，但是这些结论都不如在对蛙卵和鸡胚的研究中清楚。而我们对人类自身的神经系统发育尚没有很好的工具进行研究。另一方面，虽然人们对细胞外的信号在神经外胚层细胞发育过程中的作用有了较多的理解，对这一过程中细胞内转录因子网络的理解却所知甚少。我们在2010年Cell Stem Cell杂志上发表文章，率先通过多能干细胞的体外分化对体内胚胎发育进行模拟，研究证明了转录因子Pax6是人类多能干细胞分化为神经外胚层细胞的充分必要条件。进一步的研究显示，Pax6的这种作用是灵长类动物所特有，而不适用于小鼠。结合胚胎标本，我们进一步证实了这种差异在体外和体内是一致的。今年Sasai课题组在Nature杂志上发表文章，证明了小鼠中另一转录因子Zfp521是靶向小鼠多能干细胞到神经外胚层细胞的充分必要条件。这些实验结果提示，作为最高等的生物，人类可能在某些发育机制上和其它动物存在差异，而人类多能干细胞可以被用来对这些机制进行深入剖析。 在课题1，我们拟首先将人类ES细胞分化为神经外胚层细胞，然后再将神经外胚层细胞经过约一周左右分化为神经前体细胞。或我们将多能干细胞分别分化为神经外胚层细胞和中胚层-内胚层细胞。在通过免疫荧光检测或流式细胞分析对分化细胞纯度进行分析后（至少95%以上，多能干细胞Nanog+/Oct4+；神经外胚层细胞Pax6+/Sox2+/Sox；前脑神经前体细胞FoxG1+/Sox1+/Sox2+；中胚层-内胚层细胞Pax6-/Sox2-/T+或Sox17+），通过mRNA-Sequencing对基因表达谱进行横向和纵向比较，提炼出神经外胚层细胞有关细胞类型和分化发育阶段的特征信息，包括信号网络和转录因子网络。这些信号应包括FGF的激活，BMP信号的抑制，也可能包括其他我们未知的信号，例如Notch信号、IGF信号等。这些转录因子应包括Pax6，也可能包括其它的转录因子，例如Six3、Six6、LMO3等。与此同时，这些信号和转录因子可以相互作用和影响，信号之间和转录因子之间既可以是相互平行的关系，也可以是上下游关系。总之，通过化学和基因干预，我们可以理清这些信号和转录因子网络相互之间的关系；探讨这些信号网络和转录因子网络在神经外胚层细胞分化中的作用机制；根据这些分子网络完善神经外胚层细胞分化的技术