蛋白质层析技术解析.ppt

蛋白质层析技术 导言 生物技术有三大部分：生化分离技术；DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。其中生化分离技术是生物技术的基础和支柱。 层析是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。 基因工程下游的核心是层析。 层析技术的理论和实践已高度发展和完善。 蛋白质结构组计划 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三维结构。 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重组蛋白能够被纯化出来。 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成功的建立。 蛋白质层析分离纯化机制 电荷不同：离子交换层析 大小、形状：凝胶过滤层析 疏水区域：疏水层析 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀的） 层析介质 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生 物大分子失活，没有生物化学毒性—过强吸附、泄露。 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的。 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹性。 聚合物机体孔的结构 结构：典型层析介质的放大观察 孔的结构可分为三种类型 整体柱（monolithic column ） 概念：它是由单体、引发剂、致孔剂等混合物通过原位制备而成一个棒状整体,具有制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、具有较高的柱效和可进行快速分离等优点,已在反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了应用,并成功分离了肽、蛋白质、类固醇、芳烃、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等物质。 整体柱（monolithic column ） 大孔结构平均孔径为2μm的大孔网络，允许流动相快速通过，反压极低，从而大大降低了分离时间。 中孔结构大量孔径为13nm的“中孔”，保证了目标分子在色谱分离过程中吸附/解吸附作用所需的表面积，因此，整体化色谱柱可以在高流速时保持高柱效。 整体柱（monolithic column ） 高流速整体化色谱柱的总孔率约80％，填料具有优越的渗透性，即便使用高流速进行色谱分离，柱压也很低 ；基本不会因脏的样品而受堵，寿命长。 高柱效整体化色谱柱的柱效和3.5μm粒径的颗粒型色谱柱相当，而大大优于5μm粒径的色谱柱。并且，整体化色谱柱在流速升高时，柱效下降程度低。 整体柱（monolithic column ） 目前,商品化的聚合物整体柱有CIMTM,硅胶整体柱有SilicaRODTM和PrepRODsTM。 默克 整体柱 ChromolithTM 蛋白质纯化平台 纯化平台的硬件结构 中心设备：中压至高压层析仪 辅助设备：过滤装置，超滤装置，离心机，蛋白质电泳等 蛋白质纯化平台的结构和组成 含量较高的蛋白质纯化，基本可以在三个层析步骤中实现。 用目标蛋白的三个独立的物理化学性质进行层析分离。 几步完成纯化？ 综合考虑样品的各种性质 稳定性（PH值，活性） 疏水性 分子大小，形状。 关键辅助因子 关键杂质 产品浓度 引进污染物 产品纯度 单位成本 产量 设计合理的方案 各种机制交替试用，相互衔接、补充。（3步） 分辨率：疏水层析离子交换层析 载量： 疏水层析离子交换层析 选择性：疏水层析离子交换层析 同样的起始样品不同的纯化方案 通常纯化流程：选择性 分辨率 载量 目标蛋白为碱性蛋白，在中性附近运用阳离子交换，选择性好，除核酸多糖； 目标蛋白为酸性蛋白，则第一步层析采用分子筛，最好此前将溶液脱盐，并在含０ .２-０.４ M NaCl的缓冲液中运行，缓冲成分视下一步而定。 如果介质含聚丙烯酰胺，则应含Tris 等含氮的缓冲成分，减少 π-π互相作用造成的吸附. 梯度洗脱还是分步洗脱 蛋白质层析因为保留值差别很大，比如相差1000倍，这样能够洗脱的唯一方法就是强度递增的洗脱——阶段洗脱或连续梯度洗脱 样品通常特点及对后续纯化的影响 大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量核酸； 运行层析，则蛋白浓度不应大于10 mg/ml。 (NH4)2SO4 沉淀，通常蛋白浓度1-5mg/ml. 平台的操作（软件：知识结构） 样品处理及准备工作 用SDS监测整个流程 富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽量低强度的抽提方法。 通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要.低渗更有利于破碎，甚至可用水进行抽提（如1：4左右）； 平台的操作（软件：知识结构） 无特殊理由，pH应准确控制在中性附近，尽量用酸性buffer； 缓冲容量：在pKa附近 缓冲容量正比于缓冲溶液的总浓度； 最好运用(NH4)2SO4沉淀，缩小体积，便于保存。终止生化代谢反应，除糖、脂类。个别情形中会造成不可逆沉淀； 平台的操作（软件：知识结构） 经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可近似地将分子量相当2倍