分子杂交技术详解.ppt

第五节 核酸的分子杂交Nucleic Acid Hybridization Content of Table 前 言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术 5 生物芯片技术 核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。 1 核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe), 与变性后的单链基因组DNA或RNA进行杂交。 再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。 应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。 2 核酸探针的制备 2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。 2.2 探针的制备方法 长度一般以50~300bp为宜。制备方法： (1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成 2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： (1) 基因组DNA探针 (2) cDNA探针 (3) RNA探针 (4) 寡核苷酸探针 2.4 合成寡核苷酸探针注意原则 (1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。 3 核酸探针的标记 为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。 3.1 标记的种类 同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。 一个理想的标记物应满足： (1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。 3.2 探针的标记方法 缺口平移法的原理 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。 Klenow酶的基本用途： 补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列 随机引物标记法原理 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。 末端标记法原理 （1）一种是在5`末端加成标记法： 先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 的γ-磷酸转移加到DNA片段5`-OH上。 （2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的[α-32P]dNTP。 核酸修饰酶3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP） T4--PNP的基本特性：在DNA、RNA、ddNR、NR的5‘‘--OH上加磷,用于探针的末端同位素标记 生物素光照标记法 光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。 4 核酸分子杂交技术 此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。 4.2 Northern印迹杂交 4.3 Western印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。 4.