蛋白质结晶方法大总结课件.doc

蛋白质结晶方法大总结 1.1结晶方法(Crystallization Techniques) 1.1.1 分批结晶(Batch Crystallization) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2μl包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。 1.1.2 液-液扩散(Liquid–Liquid Diffusion) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或PEG溶液。如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。两种溶液（各自约5μl）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。 Garc′?a-Ruiz and Moreno（1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。 1.1.3 蒸气扩散（Vapor Diffusion） 1.1.3.1 悬滴法（The Hanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10μl蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。盖玻片置于一个盘子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀剂溶液约1ml。在盖玻片放好之前，小室的凹槽周围用油或油脂密封（如图3）。 1.1.3.2 沉滴法（The Sitting Drop Method）在悬滴法中，如果蛋白质溶液表面张力很小就会在盖玻片表面展开。此时，沉滴法更有利，图4给出了沉滴法的简图。 1.1.4 透析法（Dialysis） 除了上述使得蛋白质结晶的方法，还有许多透析技术。透析的优点是沉淀溶液容易改变，对于适量的蛋白质溶液（多于0.1ml），可用透析管完成（如图1.5a）。透析膜通过橡皮圈连在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮约10min。对微升量的蛋白质溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛细管（Zeppezauer method）或者树脂玻璃纽扣（如图1.5b）。纽扣的缺点是纽扣中的蛋白质晶体不能通过极化显微镜观察到。 另一中微透析方法在图1.6中有描述，将5μl蛋白质溶液注射到一个毛细管中，毛细管覆有透析膜，膜可用塑料管套紧。对蛋白质溶液进行简单离心，然后用铸模粘土将毛细管封闭，接着将毛细管放入含有透析液的Eppendorf管中。 机遇造就第一个膜蛋白晶体结构的解析 1988年诺贝尔化学奖被授予三位德国科学家，他们分别是哈特穆特·米歇尔（Hartmut Michel）、约翰·戴森霍弗（Johann Deisenhofer）和罗伯特·休伯（Robert Huber），以表彰他们对膜蛋白结构生物学的巨大贡献。这三个人通力合作，在世界上首次解析了一种膜蛋白——紫细菌光合反应中心的高分辨率三维结构。紫细菌光合反应中心三维结构的解析，拉开了膜蛋白结构生物学的序幕，在生物学界影响非常大。然而，在这样一个获诺贝尔化学奖的重大研究成果背后，却隐藏着一段不为人知的故事，其中就包涵了“抓住机遇发现科学事实”的科学方法论。 蛋白质是构成生物体的最基本物质之一，它在生物体的各种生命活动中扮演着极其重要的角色，如催化体内几乎全部反应的酶。在所有蛋白质中，膜蛋白的作用更为重要。膜蛋白位于细胞的膜系统上，充当很多角色，比如细胞膜上用来接受胞外信号的受体，以及用来转运离子和分子的离子通道和转运体。 为了解释蛋白质的具体作用机制，就必须在原子分辨率水平观察到蛋白质的三维结构，以及蛋白质和与其相互作用的分子形成的复合物的结构。这要用到一种叫做X射线晶体学的方法。据统计，X射线晶体学已造就了十多个诺贝尔奖。使用这种方法的前提是得到所研究对象的高质量单晶，若要解析某个蛋白质的结构，就首先要生长出目标蛋白的单晶。这对于一般