外泌体蛋白质组详解.pptxVIP

外泌体参与肺炎相关的急性胰腺炎 14级生技 目录 CONTENTS 第一部分 | 摘要背景 第二部分 | 材料方法 摘要背景 1 Abstract 急性胰腺炎的常见并发症是肺损伤相关的全身炎症反应。尽管研究发现在局部和全身都会产生促炎因子，但对疾病的致病机制仍不清楚。 外泌体作为细胞间通讯系统出现，有转运膜包被的蛋白质和小分子RNA，并保护其免受退化的作用。 用牛磺胆酸盐诱导的大鼠急性胰腺炎模型，评估外泌体在全身性炎症反应程度的作用 急性胰腺炎 外泌体 大鼠急性胰腺炎模型 蛋白质组 诱导胰腺炎升高了循环外泌体的浓度，得到与对照组动物不同的蛋白质组图谱 研究概述 PKH26染色和跟踪实验表明，循环外泌体能到达肺泡隔间然后被巨噬细胞吞噬 体外实验表明，外泌体在炎症条件下活化肺泡巨噬细胞并使其朝亲炎症性分化 跟踪实验还表明，肝脏保留了来自腹腔的大部分外泌体 对急性胰腺炎的循环外泌体进行蛋白质组分析，提示多器官来源的囊泡对外泌体的作用效果像一个来源的 外泌体可能是作为相关介质参与肺损伤相关的急性胰腺炎 材料方法 2 分离外泌体 1 4 3 6 2 5 分离外泌体 血浆样本（1ml ) 4℃ 2 000× g 离心 10min 10 000× g 离心 30min 回收上清 8ml PBS 30%蔗糖垫 120 000 × g 超速离心 70 min 去蔗糖 PBS洗涤 0.22μm滤膜过滤 120 000 × g 超速离心 70 min （清除外泌体相关非特异性蛋白和大分子蛋白） 从PAAF分离纤维颗粒 （纤维蛋白含量高） 分离上清 分离出的外泌体定量分析 ——测蛋白质含量 样本用5U/ml凝血酶处理10min 10 000× g 离心 5min 电子显微镜 3 4 2 1 5 电子显微镜观察 SDS和Western blot 从RIPA buffer （含蛋白酶抑制剂）提外泌体 Odyssey红外成像系统，观察免疫条带 细胞裂解液作阴性对照 洗印记，孵二抗（Dylight-800) 室温1.5h Cd63抗体（1:500）隔夜孵化 PBS+3%BSA封闭1h 含（1:10 PAAF）血浆处理外泌体5min 外泌体 降解实验 转到PVDF膜 12%SDS分离 体外巨噬细胞活化 巨噬细胞暴露在2μg/ml的循环外泌体 从对照组动物供体 获得含外泌体的肺 泡巨噬细胞培养16h 外泌体染色和跟踪分析 实验11 实验2 AP血浆样本得到的Exo-PKH26以 4ml/h的流速注射下腔静脉15min PAAF样本中得到的Exo-PKH26 以4ml/h的流速注射15min 肝门静脉 下腔静脉 处死，取肺泡巨噬细胞 （注射肝门静脉）取肝 荧光免疫分析 每组PKH26染PBS作对照 荧光免疫检测 体外条件下，通过肝门静脉向肝灌注4% 40ml多聚甲醛 PBS+1.5%BSA、5%FCS封闭 切10μm样本 房子载玻片上 样本组织在异戊烷冰浴冻存（O.C.T混合物） 蔗糖梯度 （10%-40%） 冷冻保存 M-CD163（1:100）单克隆抗体、M- Alexa488二抗预处理 切成小块 PBS洗 荧光免疫分析 LC-MS分析 蛋白提取物用测序级蛋白酶裂解，FASP (超滤管酶解) ，每个胰蛋白酶多肽混合物用TMTs标记。 混合6个标记过的缩氨酸，浓缩，用C18 SPE滤芯脱盐。 标记的样本通过分成3份，用带有nanoESI 离子源的 LTQ-Orbitrap XL 进行LC–MS分析 用Protein Discoverer软件搜索数据库通过以下参数，: 源性容差性, 20 ppm;片段公差, 0.8 Da； 酶，胰朊酶, 未酶切位点, 1； 固定修饰, 半胱氨酸碘乙酰胺化，TMTsixplex (N-端, K) ；修改变量，氧化 (M).  用DanteR 相关定量和统计学分析TMT-标记的肽段 THANK YOU!