微生物实验1-2详解.docx

实验一光学显微镜的结构和使用方法一、目的1.熟悉显微镜每一部件的结构和功能。2.掌握油镜的使用方法。3.观察细菌的基本形态。二、器材1.显微镜、香柏油、擦镜纸、纱布、洗耳球、毛刷、二甲苯或擦镜液。2.葡萄球菌、苏云金杆菌、枯草杆菌。三、显微镜的结构和功能显微镜是微生物研究中最重要的工具之一，但往往因缺乏有关显微镜光学系统，结构及操作方法等方面的知识，影响了显微镜实际使用的效果。因此，必须充分搞清显微镜中每一部件的结构和功能，熟练掌握它的使用方法，才可收到较好的效果。显微镜由光学和机械两部分组成。（一）光学部分1.物镜：物镜是显微镜上最重要的部件，由一组特殊的透镜组成，可以消除和校正球面象差和色差。它的功能除了具有放大作用外，对于分辩率有着决定性的影响。光学显微镜一般配有3-4个物镜，5-10倍为低倍镜，20-25倍为中倍镜，40-60为高倍镜，这三个物镜与样品之间的介质为空气，称之为干燥系物镜。90-100倍是油镜，物镜与样品之间的介质是香柏油，称之为油浸系物镜，用HI或oil表示。（1）放大率（2）数值孔径数值孔径又称镜口率（numerical aperfure简写为N.A）在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，是决定它们性能的最重要指标。数值孔径可用下式表示n 表示样品与物镜之间介质的折光率。a表示镜口角所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出光线与物镜前透镜之间的最大夹角（见图2）图1 物镜的各种标记图2 物镜的镜口角（3）分辨率显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别细微结构的能力，也就是它能辨别接近的两点之间的最小距离。用符号D代表可分辩的两点之间的最小距离，用下式表示。图3 油浸的作用左为干燥系统透镜，右为油浸系统透镜由上式可知，要提高透镜的分辩率，一是缩短所用的波长（），二是增大数值孔径。光学显微镜一般都是使用可见光为光源，可见光的波长在0.4-0.8微米范围，平均波长为0.55微米，可视为常数。因此，数值孔径愈大，D值愈小，透镜的分辩率愈高。要增大数值孔径，就必须增大n和a的数值。而a最大值是180°，所以的最大值是1，这事实上是不可能的。现在用的物镜最大的角为67°，sin67°=0.93，当样品和透镜之间的介质是空气（）时，只为0.93。如果将样品和透镜之间的介质换成表1 物镜的焦距和工作距离物镜倍数物镜焦距（mm）物镜的工作距离（mm）10x168.345x40.73100x1.80.14与玻璃折光率相近的香柏油（），那末可提高到1.40，所以油镜的分辩率比低倍或高倍镜要高得多。例如，在可见光照明下，数值孔径为1.25油镜分辨出物体两点之间的最短距离为微米。而数值孔径为0.65的高倍镜，能分辨出物体两点之间的最短距离为微米。如两点之间的最小距离如果小于0.4微米，在高倍镜下即混为一点，不可分辨，而在油镜下则清晰可见。另外，在油镜和样品之间加入了一种和玻璃相同折光率的香柏油，还能使光线通过玻片时边缘部分光的损失减少，增强视野的亮度。（见图3）。（4）物镜的焦距和工作距离不同放大率的物镜的焦距和工作距离（指物镜到玻片标本之间的距离）是不相同的，从表中可知，低倍物镜的焦距和工作距都比较长，而高倍物镜和油浸镜的工作距离极短，因此，在使用过程中应十分小心。（见图4和表1）图4 物镜的焦距和工作距离物镜的种类有消色差物镜、复消色差物镜、平面消色差物镜等。由于高倍物镜工作距离短，为了防止损坏物镜和样品，还装有弹簧缓冲器，有些较高级物镜还设有光圈。2.目镜：目镜由上下两块透镜组成。起着将经物镜放大的实象进一步放大的作用；也可校正物镜余留下来的色差和球面象差。显微镜一般配有5倍、10倍、15倍、20倍数个目镜。目镜种类有惠更斯目镜，用“H”表示；平周目镜，用“P”表示；广视野目镜，标有“WF”符号。3．显微镜总的放大率：显微镜总的放大率是物镜放大率和目镜放大率的乘积。可是。即使总放大率一样。由于物镜与目镜搭配不同，其分辨率也不同。如数值孔径大的40倍物镜和5倍的目镜相搭配其分辨率要比数值孔径小的10倍物镜和20倍目镜搭配高些。显微镜有效的总放大率随人们眼睛分辨率不同，一般为数值孔径的500-1000倍。因此，有时即使提高了目镜的放大率，成象反而模糊不清，分辨率也变得不好，称之为无效放大。因而，提高总的放大率应主要靠物镜，而不要指望目镜。4．聚光器：聚光器位于载物台的下方，因其作用不同，可分为明视野聚光器和暗视野聚光器两种。明视野聚光器由集光镜、虹彩光圈、滤光片架和调节螺旋组成。聚光器的作用除了将大量光线汇集成为一束强的光锥来增强标本的照明外，还可以提高物镜的分辨率，因物镜有效的数值孔径等于物镜的数值孔径加聚光器的数值孔径再除2，所以，在使用时原则上要求聚光器的数值孔径与物镜的数值孔径一致。聚光器上标的是最大的数值孔径，即是指