中山大学《细胞生物学》相关问题的分析 基因敲除技术研究进展.pdfVIP

2006 ,Vol. 23 No. 2 化学与生物工程 Chemistry Bioengineering 4　 基金项目 :湖北省教育厅青年基金资助课题 (2004D016) 收稿日期 :2005 - 09 - 14 作者简介 :刘建忠 (1967 - ) ,男 ,陕西吴堡人 ,副教授 ,博士 ,主要研究方向为动物生物技术。电话 : 027286534651 , E2mail : jzhli2 umail2003 @yahoo. com. cn。 基因敲除技术研究进展 刘建忠1 ,敖 　敬1 , 田为宇1 , 马季骅2 (1. 武汉科技大学化工与资源环境学院 ,湖北 武汉 430081 ;2. 武汉科技大学医学院 ,湖北 武汉 430081) 　　摘 　要 :基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法 ,是后基因组时代的重要研究内容。从基因敲除的细胞基 础、基因敲除载体的构建及发生同源重组干细胞的筛选、基因敲除动物模型的建立、基因敲除与基因拯救、国内基因敲除 技术的研究现状等方面概括了基因敲除技术的研究进展和该技术目前存在的主要问题。 关键词 :基因敲除 ;功能基因 ;动物模型 中图分类号 :R 587 　Q 943 　　　　文献标识码 :A 　　　　文章编号 :1672 - 5425 (2006) 02 - 0004 - 03 　　2003 年 4 月 14 日 ,美国联邦国家人类基因组研 究项目负责人在华盛顿宣布 ,始于 1990 年的国际人类 基因组计划经美、英、日、法、德和中国科学家的不懈努 力比原计划提前两年完成。通过实施人类基因组计 划 ,得到了人类几乎全部基因的核苷酸序列 ,但对于大 多数基因的功能却知之甚少。基因敲除 ( Gene knock out)是借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的 方法 ,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的 正常功能基因的编码区破坏 ,藉以揭示基因功能最直 接的手段之一 ,因此成为后基因组时代的重要研究方 法和内容。 1 　基因敲除的细胞基础 ———胚胎干细胞 胚胎干细胞 ( Embryonic stem cells , ESC) 是早期 胚胎细胞经体外抑制分化培养建立的多能性细胞系 , 体外培养时保持了未分化状态 ,可以传代增殖 ,在发育 上类似于动物早期胚胎的内细胞团细胞 ,具有与早期 胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特 点 ,是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传 机制的理想模型[ 1 ] 。 ESC 是进行基因敲除研究不可替代的材料。目 前 ,虽然体外培养乳腺细胞、胎儿成纤维细胞等细胞类 型的技术都已相当成熟 ,对这些类型的细胞进行基因 组修饰也是完全可能的 ,但 ESC 的另一特性是其它任 何类型的细胞都不具备的 ,那就是当将一定数目的 ESC 注入囊胚期小鼠的囊胚腔后这些细胞可以参与 包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成 ,在此基础 上 ,通过检测和选配 ,筛选出基因组中正常基因被破坏 的动物个体 ,通过行为观察、生理生化指标检测等手段 可以揭示该基因的作用。 迄今为止 ,只有小鼠干细胞的建系方法最成熟、效果 最稳定 ,因此小鼠是基因敲除研究的唯一的实验动物模 型[2 ] 。 2 　基因敲除载体的构建及发生同源重组干细 胞的筛选 211 　基因敲除载体的构建 构建特定基因的敲除载体必须深入了解该基因的 结构组成 ,如组成该基因的核苷酸序列、外显子和内含 子数目、特定位点的限制性内切酶的种类以及该基因 在染色体上的定位等。William 等[ 3 ] 希望研究腺苷酸 环化酶刺激性 G 蛋白 ( Gnas) 基因突变的可能结果 , 该基因有 13 个外显子 , 被定位在人类染色体的 20q 131121312 。用包含小鼠 Gnas 基因外显子 1 部分序列 的片段为探针 ,从文库中筛选出包含 Gnas 其它外显 子的克隆 , 从中获得了一个长为 610 kb、两端为 B am HI酶切位点的片段 ,该片段包含翻译起始位点 AU G上游210 kb到第 2 外显子中部的核苷酸序列。 将该片段克隆到 pBluescript II 上 ,并以之为基础构建 敲除载体。用 N coI 和 N rul 双酶切上述片段 ,将位于 AU G附近和第 1 外显子之间500 bp的片段切除 ,并插 入作为筛选重要标记的新霉素抗性基因 ( neoR ) ,从而 构建了用于实现 Gnas 基因敲除的载体。 212 　发生同源重组的干细胞的筛选 筛选发生了同源重组的干细胞的方法主要有以下 三种。 刘建忠等 :基因敲除技术研究进展/ 2006 年第 2 期 5　 21211 　Southern 杂交 该方法的原理很简单 ,即用特定的限制性内切酶 消化从经过扩增的干细胞中提取的基