052986译文正文-样本.docVIP

Nature 2008 453: 223-229 REST参与自我更新能力及发育多能性的维持 Sanjay K. Singh, Mohamedi N. Kagalwala , Jan Parker-Thornburg, HenryAdams Sadhan Majumder 受四环素调控的可诱导型RNAi的质粒表达系统是一种在哺乳动物细胞中用于基因功能研究的强大工具。但该系统并不适用于难转染的细胞系，如胚胎干细胞（特别是人的胚胎干细胞），某些原代细胞等。可诱导型的慢病毒载体的出现为这一问题的解决提供了可能。本实验中设计合成sox2 RNAi序列及egfp RNAi序列，退火后连接到pTER+载体上，然后再通过PCR的方法扩增出H1-TO-RNAi片段，最后将该片段连接到pLL3.7-H1载体上。利用三质粒系统的慢病毒包装平台，包装浓缩得到高滴度的病毒颗粒，然后分别感染tetR CGR8细胞和tetR SHhES1细胞。进一步，通过加四环素诱导RNAi序列表达，最后采用qPCR检测sox2 RNAi的效果。本实验以小鼠和人的胚胎干细胞为模型，试图建立一个慢病毒介导的可诱导型RNAi系统，为以后胚胎干细胞，特别是人胚胎干细胞有关基因的研究提供良好平台。 在小鼠胚胎干细胞（mESC）中，神经抑制因子REST（RE1-silencing transcription factor;