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第28卷，第 10期 2008 年 10 月 光谱学与光谱分析 Spectroscopy and Spectral Analysis Vol. 28.No. lO.pp2343-2347 October. 2008 红细胞显微激光共焦拉曼散射光谱扫描技术研究 康立丽L Z ，黄耀熊 l籍，罗曼1 1.暨南大学生命科学技术学院生物医学工程系，广东广州 510632 2. 南方医科大学生物医学工程学院，广东广州 510515 摘要采用显微激光共焦拉曼散射光谱扫描系统对活态红细胞进行拉曼光谱(点测定、线扫描、二维扫 描〕测定及成像的技术与方法进行了研究，并对 514 nm激光对红细胞在拉曼扫描中的影响进行了评价.通 过扫描前后细胞的拉曼光谱变化和亮场图像变化确定了在不同扫描模式下既可获得较好的拉曼散射信号， 又不会影响细胞生命活动与功能的合适扫描参数的设置.对于点扫描模式，样品激光功率是重点调节的参 数，一般应小于1. 5 mW，对于线扫描模式，照射激光功率和扫描间隔(步进)是要重点关注的参数。小扫描 间隔意味着激光能量相对聚集，易对细胞造成损伤F 大扫描闯隔可以较好地降低激光对细胞的损伤，但是空 间分辨率会因此而下降。对于线扫描，建议扫描间隔大于 0.5μn、照射激光功率小于 0.7mW. 对于二维扫 描，除照射激光功率、扫描间隔需要调节外，其他扫描参数也要作相应调节以降低激光对红细胞的影响，可 适当降低样品温度和增加共焦孔径尺寸降低二维扫描过程中激光对红细胞的影响. 1. 0 卢扫描间隔、 0.7 mW 的照射激光功率和 500μm共焦孔径，以及样品温度适当调低可得到较好的二维红细胞拉曼图像。对于 所有扫描模式，如果得到的红细胞的拉曼信号足够强，也可适当降低曝光积分时间以降低激光对红细胞的 影响，实验前进行实验过程的优化对活态细胞的拉曼测试也非常重要. 关键词 显微共焦拉曼光谱;红细胞F 扫描参数 中图分类号:创57.3 文献标识码: A 001: 10. 3964/j. issn. lOOü-0593(2008)10-2343咽 可比拟的突出优点。已有报道进行了一些研究，包括对如红 引言 细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、酵母细胞等测定[会17J. 这些 进行拉曼光谱测量时通过测定样品的拉曼散射波谱和强 度，可以获得样品分子伸缩振动、弯曲振动模式的信息[口， 从而实现对被测样品的分子结构以及含量作出判断.故拉曼 散射技术的应用一直受到人们的关注，在化学、物理、生物 医学、考古学、药物研究等多个领域有着广泛应用。尤其是 近年来共焦拉曼散射技术的发展凶，可对样品进行高分辨率 的点扫描、线扫描、 20扫描和 3D 扫描。线扫描、 20扫描和 3D扫描是一种匹配技术，匹配的结果可以显示对应样品空 间位置的分子水平的信息。因此在生物医学应用上利用激光 显微共焦拉曼散射技术进行生物样品甚至单细胞的拉曼实 验，可以获取拉曼光谱甚至拉曼图像.由于拉曼散射可在无 须荧光标记情况下对活细胞进行基本无扰、原位的测定，水 背景又不会对之产生干扰，故相比起荧光光谱与红外光谱等 技术，在研究测定活细胞尤其是连续监测单个活细胞上有无 收稿日期: 2007-05-16，修订日期: 2007-08-26 研究所使用的激发波长有 488 ， 514 ， 564 ， 632.8 和 780 run 等，为了获得足够强的拉曼散射信号，激发激光功率多在 1 -3mW之间，有的甚至更高. 利用 514.5 nm 激光进行活细胞的研究存在有利的方面， 例如在该激光作用下可得到较强的信号，而且曝光识分时间 可相对少些.对于红细胞测定，隶属于盹谱带的信号处于明 显的共振模式，而陶谱带可提供血红素吟琳环 π轨道和扩 轨道的电子数量方面的信息，被称为血红素的氧化标记 带[17]. 但另一方面， 514 nm 激光处在血红蛋白的吸收峰附 近，吸收作用也很强，容易导致活细胞因吸收作用产生的热 而损伤，而且还可能产生一定程度的荧光.因此利用 514 run 激光对红细胞或其他生物组织、或细胞送行实验研究需要采取 一些措施和手段消除或降低该波长激光带来的不利影响.尤 其是对细胞进行线扫描、 20扫描和 3D扫描测定时，由于测 量需时较长，扫描参数的优化及对实验样品的处理，就成为 基金项目:国家自然科学基金仪器专项项目 和面上项目 资助 作者简介z 康立丽，女， 1971 年生，暨南大学生命科学技术学院副教授 e-mail , k1lysz@fimmu.∞m 备通讯联系人 e-mail , ty汕田略@jnu. edu. cn 2344 光谱学与光谱分析 第 28 卷 利用 514.5 nm激光进行红细胞的拉曼光谱研究和拉曼匹配 扫描