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宏基因组学技术及其应用研究进展陈青摘要：传统培养方法从环境中只能获得1%左右的微生物，而宏基因组学技术不依赖于培养，使从环境中获得大量未能培养的微生物的研究成为现实。本文对宏基因组学的概念、宏基因组学的基本技术包括宏基因组文库的构建与筛选及其在微生物活性物质筛选中的应用等方面进行了综述。关键词：宏基因组学;文库构建；文库筛选随着科学研究进入分子水平，人们开始认识到遗传信息的巨大作用，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物体基因组携带的遗传信息，将大大有助于揭示生命的起源和奥秘，尤其是对于微生物所携带的巨大分子信息量。在过去20年我们能培养和研究的自然界中的微生物不超过1%，只有一小部分的可培养的微生物的环境样品被发现[1]。利用宏基因组技术对微生物基因组的研究，对于传统微生物学来说是一场革命。宏基因组学(metagenomics)就是利用非培养的分子生物学技术、方法和手段对宏基因组进行系统研究，即分析微生物在环境中的基因组集合。以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为目的的微生物研究方法。宏基因组技术流程为:1.从环境中提取宏基因组DNA;2.用核酸内切酶切割成一定长度的DNA片段并连接到合适的载体上;3.转化宿主菌，形成一个重组的DNA文库即宏基因组文库;4.宏基因组文库筛选。宏基因组技术采取非培养方法，从DNA提取入手构建宏基因组文库，使从研究环境中获得大量未能培养的微生物成为现实，极大的推动了环境微生物生态学的发展，为人类开发利用自然环境中微生物基因资源开辟了新的途径[2]。宏基因组学在生物科学领域取得的快速发展，主要是测序技术的发展，特别是有关生物技术的应用[3]。随着PCR技术、基因克隆技术和基因组测序技术等的逐渐成熟与完善，以及生物信息学等相关学科的发展，使环境微生物生态学得研究有了新的发展。一、土壤环境DNA样品的提取文库的构建需要足够的高质量的DNA，提取土壤DNA的难度在于土壤微生物往往会与土壤中的其他组分紧密结合。宏基因组DNA的提取纯化方法大体可分为两类[4]:1.直接提取法，又称原位提取法。这类方法不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释放，并对DNA进行纯化。该法操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。但该发放常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较小(1kb~50kb)，主要适用于小片段文库的构建。2.间接提取法，即异位提取法，利用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物细胞提取DNA。该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~500kb)，适合构建大片段的宏基因组文库。但该法操作较繁琐、费时、成本高、偏差大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%，且获得的DNA往往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。二、宏基因组学的基本技术1.宏基因组文库的构建根据插入片断大小，可以把基因文库分成两类:质粒载体的小片段插入(小于15kb)和柯斯质粒(15~40kb)或BAC(细菌人工染色体)(超过40kb)载体的大片段插入[5]。大肠杆菌(Escherichiacoli)是表达土壤细菌基因或基因簇的通用宿主，穿梭载体或BAC文库可将大肠杆菌包含的文库信息转移至其他宿主如链霉菌或假单胞菌。载体系统的选择取决于所提取土壤DNA的质量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主以及筛选方法等。剪切较严重的DNA样品适宜构建质粒文库，小片段的文库适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子;而对于含较大基因簇或大片段的DNA样品则需要构建大片段和大容量的载体文库。在进行总DNA提取后，含有大量腐殖酸等杂质，必须对总DNA进行纯化回收后才能进行后续操作，回收过程中必然造成DNA的损失，使总DNA浓度降低。此外，在常规建库过程中要将载体进行脱磷酸，而脱磷酸化后载体连接效率降低。两者结合起来使得转化子数量会很少，达不到建库的要求。马世宏等[6]在基于宏基因组学的转基因棉田土壤微生物功能多样性分析的实验中，采用生物公司合成的pUC19/BamHI脱磷载体与回收的目的片段酶连，通过TA克隆的方法来构建文库，将目的片段转入到大肠杆菌DH5高效感受态细胞中，从而达到建库的目的。2.宏基因组文库的筛选宏基因文库的筛选除了直接筛选的方法以外，还主要有底物诱导基因表达筛