核酸提取原理及常见问题分解.pptxVIP

核酸提取原理及常见问题 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 内容 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取常见问题、 原因分析及其对策 　基因组DNA的提取 　CTAB法 　SDS法 　酚氯仿法 试剂盒法 DNA提取的几种方法 　CTAB法原理 CTAB，是一种阳离子去污剂，可破碎细胞壁和细胞膜，并与核酸形成复合物。 在高盐溶液中 ( 1.4 mol / L NaCl ) 是可溶的 ,当降低溶液盐浓度到一定程度( 0.7 mol /L NaCl )时 ,从溶液中沉淀 。通过离心 , 可将 CT A B —核酸复合物同蛋白质 、 中性多糖类物质分开 。 溶解于高盐溶液中的 CTA B —核酸复合物 , 加入乙醇可使核酸沉淀 ,而 CT A B 则溶于乙醇. 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 CTAB法（植物DNA提取经典方法） 　CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) 0.1%（V/V）使用前加入 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）易于溶解。 CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 细胞裂解后释放的植物次生代谢产物和多酚类化合物易于氧化 ,氧化的多酚结合到DNA 分子上而致 D N A 降解； 多糖的性质与核酸类似，会与核酸一同沉淀下来，影响植物核酸纯度。 　CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB PVP β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 3%(W/V) 2-5%(W/V) 1-5%（V/V）使用前加入 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。 改良方法 1 改良方法 2 加入核酸分离缓冲液，利用高温加热裂解细胞，去除部分杂质，离心得到细胞核； 针对多糖组织，得到细胞核之后可加入1XPBS清洗2-3次，去除多糖； 后续使用CTAB裂解液裂解细胞核。 核酸分离缓冲液：200mM Tris-HCl 50mM EDTA 250mM NaCl 2%PVP 　CTAB法流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 SDS法原理 SDS法 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 　组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH 8.0 ） 　NaCl SDS 　终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2% SDS法DNA提取缓冲液 SDS 法操作简单 , 温和 , 也可提取到较高分子量 DNA ,但所得产物含糖类杂质较多 CTAB法的最大优点是能较好地去除糖类杂质 SDS法流程图 酚氯仿裂解法 苯酚抽提原理： 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用 酚的缺点： 能溶解10-15%的水。 最后用氯仿抽提：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层；去除核酸溶