分子生物学(10个主干实验)步骤知识.docVIP

《生物学实验四》实验操作步骤 2010年3月 实验一、细菌培养、细胞培养 实验二、昆虫病毒DNA的分离、纯化和鉴定 　1、2 ml病毒感染的培养细胞悬浊液 ↓8000 r/min 4℃ 10min，去上清 2、 加PBS漂洗混匀 ↓ 8000 r/min 4℃ 10min ，去上清 3、加250μl TE 悬浊 ↓ 4、加250μl Lysis　Buffer裂解细胞 ↓ 5、 加20μl Proteinase K（10mg/ml ） ↓50℃ 4h /37 ℃ 过夜 6、加3μl RNase A（10mg/ml ） ↓37℃ 30 min 7、 加等体积酚-氯仿 ↓12000 r/min 4℃/10min 取水相（剪枪头，烤平） 8、重复步骤7 9、水相加1/10体积 3mol/L NaAC（pH4.8） ↓ 10、加2倍体积的无水乙醇沉淀病毒DNA ↓-20℃，过夜 ↓12000 r/min 4℃/5min，去上清 11、70% 乙醇洗涤沉淀 ↓12000 r/min 4℃/5min 去上清 12、重复步骤11 13、适量TE 溶解 ↓ 14、电泳鉴定 实验三、PCR扩增昆虫杆状病毒基因及其产物的鉴定PCR反应体系 TaqDNA 聚合酶 0.5μl 10×PCR Buffer 5μl dNTP 4μl Template(病毒基因组DNA) 1μl Primer1 1μl Primer2 1μl ddH2O 37.5μl —————————————————— Total 50 μl 2、PCR反应程序： 94 ℃ 3min 94 ℃ 30s 55 ℃ 30s 3 cycles 72 ℃ 1min 72 ℃ 10min 4 ℃ forever 实验四、质粒DNA的分离、纯化和鉴定LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜 ↓ 2.取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，4℃ 3000r/min 离心5min ↓ 3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 ↓ 4.碱法少量快速抽提质粒DNA（详见4） ↓ 5. 质粒DNA的鉴定DNA 单菌落 Sup ↓接种 ↓ 3ml LB培养基（含Amp或Kan 100ug/ml） add 等体积酚：氯仿（1：1） ↓ ↓混匀 37℃ 200rpm振荡过夜培养 4℃、 12000rpm、 10min ↓ ↓ Sup ↓ 取1.5ml培养物于Eppendorf管内 add 2×Vol无水EtOH ↓ ↓混匀