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使用纯化基因的发育生物学研究 作者 唐纳德.D.布朗 翻译 罗长春 一些历史 三年的大学过后，1952年的秋天布朗进入了芝加哥大学医学院开始了生物化学的学习和研究。生物化学系噬菌体研究组的劳埃德 兹洛夫 胚胎学，当时被称作“发育生物学”，引起了他的注意。生殖生物学几乎没有被讨论到，描述胚胎学也仅仅是作为大体解剖学的一部分上了两堂课。1953年，他参加了一个讨论沃森-克里克发表在《科学》周刊上描述DNA结构的文章的一个生物化学杂志俱乐部，当时立刻就意识到自己将来会从事DNA、生物化学和胚胎学的交叉研究。 在新奥尔良慈善医院的实习过后布朗结了婚，之后和妻子一起搬到了马里兰州的贝塞斯达约翰·霍普金斯医学华盛顿卡内基研究所吉姆·艾伯特贾克·莫诺方斯华·贾克柏安德烈· DNA重组时代之前的基因分离 布朗选择豹蛙的胚胎作为研究对象。它的卵可以在体外受精，而且所有胚胎同步发育，因此提供了无穷的生化研究素材。他在巴斯德学院的时候，两个小组分别独立发现了信使RNA (mRNA)，对细菌的研究也清楚的表明核糖体RNA (rRNA)和转移RNA是基因的直接产物。在这之前，胚胎研究中认为“微分基因作用”是酶活性的波动，进而代表了蛋白质数量的变化。布朗意识到，由于RNA与基因的关系比蛋白质与基因的关系要近，对RNA的分析会是对基因表达变化的更可靠地反映。 在20世纪60年代早期，蔗糖密度梯度离心就已经被设计用来分离三类常见RNA的大小：18S和28S RNA ,小分子RNA和一种认为包含了新发现的mRNA的异质类DNA RNA。他发现这三种不同大小的RNA在发育阶段的合成速率有着极大地差距。尽管未受精的蛙卵是单细胞的，它仍然含有和多细胞机体组织，如肝脏，一样数量巨大、质量相同的核糖体。新的rRNA在胚胎发育到10000个细胞之后才开始合成，但是新合成的核糖体在几天之内并没有实质上改变核糖体的总含量。 布朗在卡内基医学院的第一项发现是胚胎在蒸馏水中不发育。它们需要的四种阳离子按发育阶段来说分别是-钙离子、钠离子、钾离子和镁离子。镁离子缺乏症特别有意思，因为如果缺少镁，胚胎发育几天之后就会在蛙胚胎开始增加rRNA总量的阶段被阻滞为游动的蝌蚪。众所周知，镁元素将核糖体聚在一起。1962年，他读到了一篇关于非洲爪蟾的变种核仁的数目发生变化的文章。野生型的细胞核内有两个核仁，杂合子细胞核内有一个核仁但表型很正常。两个杂合子杂交可以产生典型的孟德尔子代比率，其中有四分之一的子代没有核仁。这些纯合突变体的发育和正常缺镁胚胎停滞在同一个时期（图1），使他设想突变会影响新核糖体的合成。 对照组 缺核仁组 缺镁组 图 1. 发育四天后的非洲爪蟾胚胎对照组（左）、缺核仁组（中）、缺镁组（右）的对比，缺镁和缺核仁将胚胎发育组织在同一时期。来自参考文献2. 这种变种唯一的来源就是当初发现它的牛津实验室。同时，布朗了解到非洲爪蟾从非洲进口是为一位企业家做受孕实验用的，而他就住在离布朗仅仅十英里远的巴尔的摩郊区。布朗立即就把注意力从豹蛙转移到了非洲爪蟾上。牛津的约翰.茄当和布朗成立一个小组来验证缺核仁突变体不合成18Ｓ或２８ＳRNA。这些突变的胚胎能够正常合成另外两类RNA。马克斯.伯恩斯蒂尔和他在爱丁堡的同事进行了下一步实验。众所周知，rRNA碱基的构成中ＧＣ比要比DNA中高很多。应用杰罗姆.文欧格瑞德开发的平衡CsCl离心分离方法，伯恩斯蒂尔和他的同事表明编码rRNA的基因与大簇DNA是分离的，并且在缺镁突变体中缺失。通过分子杂交技术他们也表明非洲爪蟾的单倍体中有几百个拷贝编码rRNA的基因与DNA互补，而且它们必须聚成一簇，但是单个突变体中把它们全部都敲除了。 平衡CsCl离心分离成为了下一个十年中最重要的分离不同碱基构成DNA的方法。这使得伯恩斯蒂尔成功提纯了非洲爪蟾的核糖体DNA（rDNA）。这是第一次从有机体中分离出基因。1966年，在乌拉圭的蒙得维的亚奥斯卡·米勒两栖动物卵母细胞核 图 2. 非洲爪蟾成熟卵母细胞中分离出的细胞核，核直径约400微米，甲酚紫染色 在DNA测序和重组技术发明以前，这些小基因对于细节特征和功能研究特别有用。他们研究出垫片DNA把串联基因分离开来（图3）。在非洲爪蟾的不同品种之间这些垫片是很不同的，但是基因却高度保守。然而在种内，垫片却高度相似，产生了一种他们称作水平进化的现象。每一个5S rRNA基因拷贝中都有一个假基因。 第一个被完全测序的真核基因是妮娜.费德洛夫和乔治.布朗利完成的染色体5S DNA 片段。布朗小组发现在非洲爪蟾基因组中有多个5S rRNA基因家族。最大的一个只在卵母细胞中表达，他们称之为“二重5S rRNA基因系统”，他研究了10余年。5S DNA是卵母细胞核粗提物中一个精确转录的模板，