基本细胞实验大全及注意点.docVIP

细胞实验 1.CCK-8实验步骤(4天) 接种1000-5000个细胞到96孔板中，加入200ul的培养基，在培养箱中培养（过夜） 换新鲜的培养基，加入20ul的cck-8溶液 分别在0.5h、1h、2h、4h时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度（即OD值） 制作图表 注意事项：1.接种细胞时，细胞的数目不能相差太大； 加入cck-8溶液时，要注意避光，且不能有气泡，否则会影响结果； 3.酶标仪测OD值时，最好设计一个对照波长。 ranswell实验 收集细胞并计数 接种2X105细胞/200ul于transwell小室，小室外加入500ul的完全培养基 上室中加入4ug/ml mitomycin共培养，培养12h、24h后，分别取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层细胞，4%PFA固定20分钟棉签擦去微孔膜上层细胞， 姬姆萨染色： 加入0.5ml的姬姆萨A液，染色1min 再加入1ml的姬姆萨B液，轻轻摇匀，染色10min 水洗，干燥 镜检：在显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野 铺6孔板，细胞长到95%以上时，待用 加入4μg/mL 的mitomycin C，5%CO2 37℃培养2h 每孔划3或5条痕，PBS洗两次，加入4μg/mL 的mitomycin C，拍照，即为0h的数据 在6h、12h、24h、48h分别拍照 1.细胞的密度要足够大；2.划痕时要在有培养基或PBS的情况下进行；3.划痕后，要清洗干净，痕中最好不要有细胞残留；用超纯水把10X Binding Buffer稀释为1X Binding Buffer（即1ml Binding Buffer+9ml ddH20） 收集细胞，PBS洗一次，再用1X Binding Buffer洗一次 用1X Binding Buffer重悬细胞，并计数，细胞数为1-5x106/ml 收集细胞，加入5 μl Annexin V和95μl 1X Binding Buffer，室温孵育15min 用1X Binding Buffer洗一次，离心，收集沉淀 200μl 1X Binding Buffer重悬，再加入5 μl 7-AAD溶液，混匀， 流式细胞仪检测，分析数据μl1X Binding Buffer，打均匀 3、加入5μlV-PE,10μl 7AAD，在冰上孵育15分钟。 4、加入380μl冻Buffer 5、移入离心管，交流式室。 注意事项：1.细胞数要足够；2.加入7-AAD后，可2-8℃避光保存，但必须在4h内检测 离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次 加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定 细胞染色：离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS（含50ug/mL溴化乙锭（PI），0.2% Triton X-100）4℃避光孵育30min 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数1X105个细胞以上，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。1.4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天检测，那就保存在-20 ，但最好在一周内进行检测； 2.RNA酶可加可不加，对结果的影响不大； 3.细胞数要足够多，一般来说要比做细胞凋亡的细胞数多； 6.克隆形成（软琼脂糖） 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。 按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。 把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系1.试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。 2.接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。 3.正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验