基础生化实验-DNA聚合酶连锁反应DNA电泳分析.docxVIP

DNA聚合酶连锁反应DNA电泳分析DNA聚合酶连锁反应目的：聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)能短时间增殖、放大特定的DNA片段，而使得原先可能才只有几个pg的DNA增加至mg，以利于其它实验的进行。原理：(1)变性反应(denaturation),使DNA的两股分离。(2)缓冷配对反应(annealing)，使引子与目标DNA配对。(3)延长反应(extension)，合成新的DNA股。每一个循环操作可使DNA的量添加一倍，若重复操作多次，以数学公式计算，DNA增加的量将会是2n，n是代表重复操作的次数。在理想的聚合酵素链锁反应条件下，DNA是以几何级数增加。理论上，一个DNA分子若重复操作PCR 25次，那么DNA的分子数将会扩增分子。这个DNA的量已足够在Agarose凝胶电泳中观察到。试剂、器材、仪器： (1)10x PCR buffer成分：500mM KCl、100mM Tris-HCl、pH8.8、15mM MgCl2、1% TritonX-100 10μ1※Taq DN聚合酶需要有Mg2+( MgCl2)才能进行反应；但是Mg2+会和带负电的 template、primer和dNTP结合，加强双股DNA的键结。所以Mg2+的浓度会影响PCR的效率和特异性，Mg2+过低PCR产物会减少，此外Mg2+解冻时会有沉淀产生。 (2)dNTP成分：dATP、dCTP、dGTD、dTTP各1.25mM 16 μ1※dNTP会和Mg2+结合，所以过量dNTP会影响Mg2+浓度。※过多的dNTP也会增加Taq的错误率和抑制其活性。此外当某一种dNTP的浓度较其它三种低时也会增加错误率。 (3)Primers是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，存在于自然中生物的DNA复制(RNA引子)和聚合酶链锁反应(PCR)中人工合成的引子(通常为DNA引子)。 (4)Taq DNA polymerase从热泉中的嗜热性细菌(Thermus aquaticus)所分离出来的耐高温DNA合成酵素，每秒大约合成150个核甘酸。 (5)dH2O灭菌水。 (6)PCR管为了使加热均匀且快速，所以PCR专用管都是薄壁的。使用一般微量管取代，在时间控制上会有差异。常用的PCR管有0.2mL与0.5mL两种体积；0.2mL管各家厂商都只有作薄壁的，但0.5mL管有分一般与PCR用，使用前需注意。不过现在用0.5管的PCR仪越来越少了；新机种都是用0.2管，甚至0.1半量管或384孔盘。(7)PCR仪器将PCR步骤自动化的仪器步骤：1.将试剂滴入PCR管混合均匀2.将PCR管制入PCR仪器3.设定反应条件，反应完毕即为所求DNA电泳分析目的：用电泳的方式来测量样品DNA的纯度及分子量大小，以利于其它实验的进行。原理：DNA电泳主要是利用：1.正负电场 2.DNA本身带负电 3.电泳胶内部形成各种大小不同的孔洞DNA是高度负电荷的聚分子，且负电荷是均匀分布于骨架的磷酸根上，因此不论长短，DNA的负电密度(即单位质量带有的负电荷数目)是相同的，因此在电场中感受的引力就相同 (差异不大)。所以电泳 DNA并不是依分子的电荷差异而分离，而是依分子大小、构形差异而分离。一般而言，片段小的DNA因为可以穿过较小的孔隙，所以泳动速度较快，而大片段DNA只能通过大孔洞，所以速度较慢；分子的形状也会影响电泳的速率，一般而言，速率大小为：超螺旋环型线型。此外，电泳 DNA时，电压的强度、胶体的浓度、及缓冲剂的种类都会影响移动的快慢。试剂、器材、仪器：(1)电泳用染剂功能如问题二所述 (2)1% agarose gelagarose gel 的介质孔隙较大，polyacrylamide gel的孔隙较小。所以分离大分子DNA时，会依照有否连接载体、是否切割完全、样品中 DNA 大致的分子量等调配适当比例的agarose，一般 0.8% agarose 适合区分 0.5~10 Kb DNA。若DNA size更大则须调降 agarose的浓度比例 (0.3%)；若分离的DNA较小则需升高agarose的浓度 (2%)。其实DNA的分离不尽然一定是agarose，例如操作 DNA sequencing时，为了更细微的比较，会使用 olyacrylamide gel。 (3)Sybre Green能嵌入DNA碱基中，经UV光照射能放出可见光 (4)TAE电泳缓冲溶液做为缓冲溶液(5)DNA MARKER做为分子量的对照组(6)电泳槽 (7)数字影像系统 (8)微波炉步骤:1.将TAE与agarose依适当比例混合加热。2.将1之混合液倒入agarose制备槽并去