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角化细胞(KC)培养研究进展 提纲 KC来源及分化过程 KC的作用 KC培养方法 滋养层细胞培养 无滋养层细胞培养 影响KC培养的的因素 霍乱毒素(CT)、表皮生长因子(EGF)和钙离子(Ca2+) 一、KC来源及分化过程 KC来源及分化过程 皮肤主要由表皮和真皮组成，中间由基底膜隔开； 表皮由上至下分别为角质层、颗粒层、棘层和基底层； KC主要来源于基底层。 1.皮肤结构和KC来源 KC来源及分化过程 表皮干细胞 定向祖细胞 终末分化KC 凋亡KC 10-14d 干细胞含量较少，通常处于静息状态，分裂缓慢，短时间获取大量干细胞难度大；而定向祖细胞具有分化潜能且分裂较快的优点。 桥粒和角化包膜形成 2.KC分化过程 二、KC的作用 KC的抗菌作用 1. KC通过PRR识别病原体 Kollisch等(2005)用RT-PCR方法发现KC可表达不同的TLR亚型。 PGN、poly (I:C)和flagelli可分别与KC的TLR2、TLR3和TLR5结合，从不同程度刺激KC分泌IL-8 说明KC可通过TLR识别细菌上的病原相关分子模式(PAMP)，分泌IL-8等物质清除病原体。 KC的抗菌作用 2. KC分泌AMP杀灭病原体 Glaser等(2005)用抗菌测试试验发现抗菌肽S100A7可特异性的杀死大肠杆菌。 ONG等(2005)研究发现LL-37能有效杀灭葡萄球菌。 KC在抵抗外来微生物入侵中的另一个重要作用是产生大量的AMP。阳离子抗菌肽主要有LL-37、防御素和S100蛋白家族(Harder and Schroder, 2005)。 三、KC的培养方法 KC培养最早始于1967年(Briggaman等，1967) ，随后人们陆续培养出鼠(Marvin等，1971)、兔(Liu等，1978)和狗(Wilkinson等，1987)等的KC。 使用的培养方法包括滋养层培养法和无滋养层培养法。 滋养层细胞培养 1.以3T3细胞作为滋养层 1975年，Rheinwald等首次成功地在体外连续培养人正常KC。 他们把射线灭活的鼠3T3细胞作为滋养层，将胰蛋白酶消化后的单个KC接种于其上，发现KC能明显抑制3T3细胞，且自身生长良好，并将3T3滋养层细胞不断推至培养皿边缘。 图中红色为KC，蓝色为3T3细胞 滋养层细胞培养 1.以3T3细胞作为滋养层 Alain等(1986)用3T3滋养层培养法成功培养了人头皮毛囊KC。 5d 18d 滋养层细胞培养 2.以成纤维细胞作为滋养层 Alain等(1989)首先介绍了用自体成纤维细胞代替3T3细胞作为滋养层，成功培养了人头皮毛囊KC。 真皮成纤维细胞 丝裂霉素C 或射线 有丝分裂后细胞 成纤维细胞滋养层 KC 接种 6d 3weeks 滋养层细胞培养 优点：细胞接种密度低、增殖速度较快、细胞生长稳定；而且灭活的3T3细胞自身无生长能力，有利于接种的KC生长增殖。 弊端：一反面可能会造成KC和3T3细胞的混合污染，另一方面存在着将3T3细胞DNA遗传信息整合入增殖的KC内的危险。 无滋养层细胞培养 Wilkinson等(1987)率先用无滋养层方法成功分离培养了狗KC。 皮肤组织 分离酶 4℃孵育18h 表皮 KC 培养、传代 20℃孵育45min 特定培养基 吸管吹吸 无滋养层细胞培养 Hager等(1999)用无滋养层方法成功分离培养了小鼠KC，并将其传至第19代，但只有前10代细胞具有分化能力。 真皮 胶原酶 纱布过滤、离心 混合细胞 成纤维细胞 成纤维细胞条件培养基 HCM EMEM.06 EMEM.06(1:1) KC培养基 无滋养层细胞培养 Caldelari等(2000)在Wilkinson方法基础上成功分离培养了17.5d小鼠胚胎KC，并在传至第61代依然保持分化活性。 17.5d小鼠胚胎皮肤 分离酶 defined keratinocyte-SFM 表皮 KC 培养、传代 剪碎 胰酶消化 defined keratinocyte-SFM 提高Ca2+浓度后，Keratin和E-cadherin表达呈阳性，且浆膜外形成排列紧密的角蛋白网络，细胞间形成稳定的连接结构，说明细胞仍保持分化活力。 无滋养层细胞培养 有学者认为无滋养层培养的细胞缺少分化标记物(中间丝蛋白、张力原纤维和桥粒)的表达(Prignano等，1999)； 小鼠KC在培养30代后会出现非整倍型染色体。 四、影响KC培养的因素 人为因素 接种密度、传代时间 培养基 无血清培养基、霍乱毒素(CT)、表皮生长因子(EGF)和钙离子(Ca2+) 影响KC培养的因素 1.霍乱毒素(CT) CT是分子量为8400D的蛋白质，由A和B两个亚基组成。B亚基可将腺苷酸环化酶结合到细胞表面，A亚基可激活