第二章体外细胞培养的基本要求讲述.ppt

第二章?? 体外细胞培养的基本要求 二、合适的生存环境 恒定适宜的温度 细胞培养的的最佳温度主要取决于细胞供体的体温，此外也受解剖部位体温差异的影响，如皮肤温度低于骨骼肌的温度。 ● 大多数人和哺乳动物细胞系适合温度是35℃～37℃；鸟类和禽类细胞温度要求较高，为38.5℃， 37℃ 时生长缓慢；昆虫细胞的最佳生长温度为27℃；冷血动物的细胞系可耐受的温度范围较广(15℃～26℃)。 ●细胞对低温的耐受比高温的耐受强，与温度过低相比，细胞培养时温度过高是更为严重的问题，因此通常将培养箱的温度设定为略低于最佳温度。 ●培养细胞置4℃下数小时后，恢复到37℃细胞仍能良好生长。 ●低温冷冻技术可长期保存细胞。 ● pH 大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH7.4，而且不同细胞系间差异极小。有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境(7.0～7.2)中生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合轻度偏碱性的环境(7.4～7.7)。昆虫细胞系最适pH值为6.2。总体而言细胞耐酸比耐碱强，在偏酸性环境中更有利于生长。 ● 促生长因子及激素：主要来源于血清，对于维持细胞功能、保持细胞状态十分重要。各种生长因子的作用明显并具有特异性，激素类物质也具有促进细胞生长增殖的作用。 ● 促细胞贴附物质：体外贴附型细胞在生长过程中，多需要促细胞贴附物质，不同种类的促细胞贴附物质具有不同的促细胞贴附特性。 第二节 培养用液 二. 培养液： 与培养基的含义几乎相同，英文均为medium，按来源分： （一）天然培养基(Natural Medium) 主要指来自动物体液或利用动物组织分离提取的一类培养基，如血清、血浆、淋巴液及鸡胚浸出液等。含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、 pH等也与体内环境相似，但制作过程复杂、批间差异大。 ● 细胞系的建立、传代和贮存 ● 培养液的配制 ● 相关实验(免疫学、分子生物学和细胞生 物学实验，以及某种特定目的的实验等) 二、设备仪器 ● 恒温培养箱 目前常用的为CO2培养箱，可恒定地提供一定浓度的CO2(2%～5%)；维持培养液较稳定的pH值。造成培养基pH波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2，在封闭式培养过程中CO2与水结合形成碳酸，培养基pH很快下降。开放式培养采用NaHCO3- CO2缓冲系统，一方面能使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养容器；另一方面可通过稳定调节培养箱CO2的浓度，使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。 NaHCO3＋H2O----Na＋＋HO－＋H2O＋CO2↑ 应用CO2培养箱须注意： ◆ 维持一定的CO2浓度 ◆ 保证开放式培养(通气) ◆ 定期消毒(内置紫外灯、酒精) ◆ 一定的湿度，避免培养液蒸发 ● 过滤除菌装置 ◆ 正压抽滤装置 ◆ 负压抽滤装置 ◆ 一次性微孔滤膜滤器 滤膜的孔径0.8μm、0.45μm、0.22μm和0.1μm等几种，除菌需要采用0.22μm滤膜。 三、一般器械 ●主要用于解剖动物、取组织和原代培养中切割组织，如解剖刀、解剖剪、镊子和止血钳等，眼科剪、眼科镊。 ●细胞筛网：主要用于过滤经消化处理的细胞悬液。 ●细胞刮刀(Cell Scraper)：用于刮除贴壁的培养细胞。 ●插入式培养皿(culture plate insert) ◆ 细胞培养皿 用于分离、培养组织细胞，也可用于测定集落形成的软琼脂培养，常用规格直径为60mm ◆ 细胞培养板 96孔、24孔、6孔、4孔 ◆ 细胞记数板 ● 其他用品：移液管和吸管、离心管(离心、漂洗和分离细胞) Millicell插入式细胞培养皿,又名细胞培养小室，Transwell小室等Millicell插入式细胞培养皿有直径12mm和30mm两种规格，适合大多数标准的24孔和6孔板使用。方便用于SEM和TEM技术，与细胞和荧光染色相容。与塑料培养板上的细胞相比较，生长在Millicell插入式细胞培养皿上的细胞更能代表其体内状态；使用微孔膜可以使培养基到达细胞的两侧。Millicell插入式细胞培养皿可改善细胞