1细胞样品RNA的抽提、逆转录(RT)及实时定量PCR(qPCR)测定课案.pptxVIP

细胞样品RNA的抽提、逆转录(RT)及实时定量PCR（qPCR）测定 分子医学教育部重点实验室 郭亮 2014. 04. 15 E-mail: liangguo@fudan.edu.cn Office: 13#511 Tel: 021实验目的 了解RNA抽提原理 熟悉RNA抽提方法 掌握RNA操作注意事项 了解RT-qPCR的原理 熟悉RT-qPCR的方法 核 酸(nucleic acid) 是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，除了携带和传递遗传信息(DNA)，还发挥许多重要的生物学功能(RNA)。 核酸的分类及分布 存在于细胞核和线粒体 分布于细胞核、细胞质、线粒体 (deoxyribonucleic acid, DNA) (ribonucleic acid, RNA) 脱氧核糖核酸 核糖核酸 携带遗传信息，并通过复制传递给下一代。 是DNA转录的产物，参与和调节遗传信息的复制与表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体 核酸组成 DNA and RNA 有何不同 G,C,A,T G,C,A,U 脱氧核糖核苷酸(DNA) 核糖核苷酸(RNA) DNA and RNA 有何不同 DNA: 双链，稳定性高，可以保存很久，主要在核内。 功能较单一，主要发挥携带遗传信息的作用 DNA and RNA 有何不同 RNA: 单链，稳定性差，容易形成二级结构 核、胞浆、线粒体、体液等都有，功能广泛。 DNA and RNA 有何不同 双链DNA 由于2号位含有氧，使RNA的磷酸二酯键在碱性条件下易受破坏进而断裂。 RNA DNA DNA中的嘧啶 RNA中的嘧啶 C和U结构类似，一旦发生C?U突变,机体的纠错系统不易识别。 RNA的量及类型却因细胞种类以及细胞状态的不同而有很大差异 DNA and RNA 有何不同 同一个体的不同细胞中，DNA含量基本相同 RNA的种类和功能 种类 百分比 功能 mRNA 2-5% 蛋白质合成模板 rRNA 80% 核糖体组分 tRNA 15% 氨基酸转运 其他非编码RNA lncRNA (200nt) .. 非常复杂：基因沉默、蛋白相互作用等 sncRNA (200nt) snRNA .. 内含子加工剪接 ribozyme .. RNA剪接修饰 siRNA .. 降解mRNA miRNA .. 基因表达调节 … … … DNA是遗传信息的主要携带者 而RNA以及蛋白质是遗传信息的主要执行者 RNA抽提实验原理 抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质，常用异硫氰酸胍/酸性酚法(Trizol); 细胞在异硫氰酸胍和酚的作用下被裂解，蛋白变性，核酸释放； 异硫氰酸胍是RNA酶的强效抑制剂，保护RNA免受降解； 加氯仿共抽提，促进有机相和水相分层；释放出来的DNA和RNA由于在PH值5.1的条件下溶解度的不同，分别位于中间层和上层水相； 吸取上层水相，将RNA与蛋白质、DNA分离； 最后利用异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，即可获得纯化的总RNA。 保证Trizol过量： 1、防止RNA降解； 2、以免PH值变中性，造成DNA溶解进入上层的水相； 3、影响蛋白质变性的效果，造成蛋白质的污染。 异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖、盐不产生沉淀。 RNA不要晾太干，以免影响后续溶解； 溶解RNA的水需经 RNA酶抑制剂(DEPC)处理。 RNA产物的鉴定 RNA的纯度与含量用紫外分光光度法检验； 高纯度RNA的A260/A280处于1.9至2.1之间最佳，偏小说明蛋白质污染，偏大说明RNA有部分降解； A260与RNA浓度呈正比，1 OD = 40μg/ml RNA； RNA的完整性可通过电泳检测 RNA为单链分子，二级结构复杂，需先经甲酰胺变性，再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。 细胞总RNA以rRNA含量最高，电泳时可观察到18S与28S rRNA两条清晰条带，且亮度之比接近1:2，表明RNA没有发生降解。泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带，主要由5S、5.8S rRNA 与tRNA组成。 RNA电泳结果示意图 RNA电泳结果凝胶成像图 DNA或者蛋白污染时的电泳情况 少说话，戴口罩、手套 操作注意事项 DEPC是强烈的烷化剂，通过与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶活性，是消除外源性RNA酶的主要方法。但DEPC有致癌作用，并具有很强的反应性，因此注意： 使用时，不直接接触 DEPC处理的器皿和水必须经高压灭菌处理，使DEPC分解后使用。 RNA纯化的质量决定了后续实验的成功与否 什么是RT-PCR/qPCR 包含两个步骤: RT