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细胞生物学实验方法与技术 METHODS AND TECHNIQUES OF CELL BIOLOGY 内容提要 第一节 显微技术 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜 四、显微操作技术 第二节 生物化学与分子生物学技术 第三节 细胞分离技术 第四节 细胞培养与细胞杂交 第一节 显微技术 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 扫描隧道显微镜：隧道效应（隧道电流） 1752年，英国人J. Dollond 发明消色差显微镜。 1812年，苏格兰人D. Brewster 发明油浸物镜，改进了体视显微镜。 1886年，德国人Ernst Abbe 发明复消差显微镜，并改进了油浸物镜，至此普通光学显微镜技术基本成熟。 1932年，荷兰籍德国人F. Zernike成功设计了相差显微镜（phase contrast microscope)，并因此获1953年诺贝尔物理奖。 1932年，德国人M.Knoll和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。 1981年，瑞士人G. Binning和H. Rohrer在IBM苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。 —、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 3. 分辨率：指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61λ/N．A． 表一、几种介质的折射率 表二、不同光线的波长 显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin α 的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400~700nm，分辨率数值不会小于0.2μm（ R=0.2μm是光镜的极限，显微镜无论制作的如何精密，都无法突破这一极限）；人眼的分辨率为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。 （二）荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为紫外光或蓝紫光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 （三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 （四）暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 （五）相差显微镜（phase-contrast） 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 原理 用途：观察未经染色的玻片标本 （六）偏光显微镜polarizing microscope （七）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC） （八）倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒，一般在载物台之下，倒置在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。 （九）当代显微镜的发展趋势 （一）透射电子显微镜transmission electron microscope, TEM1. 原理 电子显微镜的基本构造 电镜与光镜光路图比较 电镜与光镜的比较 2、制样技术 1）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 2）负染技术 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥