补体溶血实验讲述.ppt

实验三 补体溶血实验 补体溶血实验 补体：一组存在于人和脊椎动物血清中及组织液中具有酶样活性，不耐热和功能上连续反应的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，在正常情况下，血清中的补体大多以无活性酶前体形式存在。 物理性质：不稳定，易受各种理化因素的影响，加热，紫外线照射，机械震荡，酸碱和酒精等因素均可破坏补体。 灭活：56℃加热30min即可灭活 补体系统的生物学功能 （1）溶菌和溶细胞作用：补体系统激活后，在靶细胞表面形成MAC，从而导致靶细胞溶解。 （2）调理作用：补体激活过程中产生的C3b、C4b、iC3b都是重要的调理素，可结合中性粒细胞或巨噬细胞表面相应受体，因此，在微生物细胞表面发生的补体激活，可促进微生物与吞噬细胞的结合，并被吞噬及杀伤。 （3）引起炎症反应：在补体活化过程中产生的炎症介质C3a、C4a、C5a。它们又称为过敏毒素，与相应细胞表面的受体结合，激发细胞脱颗粒，释放组胺之类的血管活性物质，从而增强血管的通透性并刺激内脏平滑肌收缩。C5a还是一种有效的中性粒细胞趋化因子。 （4）清除免疫复合物：机制为：①补体与Ig的结合在空间上干扰Fc段之间的作用，抑制新的IC形成或使已形成的IC解离。②循环IC可激活补体，产生的C3b与抗体共价结合。IC借助C3b与表达CR1和CR3的细胞结合而被肝细胞清除。 （5）免疫调节作用：①C3可参与捕捉固定抗原，使抗原易被APC处理与递呈。②补体可与免疫细胞相互作用，调节细胞的增殖与分化。③参与调节多种免疫细胞的功能。 补体激活的途径： 经典途径 旁路途径 MBL途径 相同点：三条途径有共同的末端通路，即形成膜攻击复合物溶解细胞。 2、替代途径（旁路途径）:是指不经C1、C4、C2活化，而是在B因子、D因子和P因子参与下，直接由C3b与激活物结合启动补体酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。在感染早期可为机体提供有效的防御机制。其激活物是病原微生物等提供接触表面 3、MBL途径：在感染早期，体内分泌甘露聚糖结合凝集素(MBL)和C反应蛋白。MBL与细菌表面的甘露糖残基结合，然后与丝氨酸蛋白酶结合形成MASP（MBL相关的丝氨酸蛋白酶），MASP继而水解C4和C2启动后序的酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。激活物（或激活剂）是炎症期产生的蛋白和病原体。 三条途径的区别见下表 补体的来源、采集 实验室常用豚鼠、兔的新鲜血清作为补体的来源。 补体的采集：一般选用3-5只健康未妊娠的豚鼠或兔子，以无菌操作采集血液，采集好的血液置4℃冰箱过夜，次日离心分离血清即可分离到补体。 溶血素（抗绵羊红细胞抗体）：是以SRBC作为抗原免疫家兔所得到的兔抗血清，无需进一步提纯，但试验前应先56℃加热30min或者60 ℃3min灭活补体。 溶血反应：由于抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行特异性的结合，在电解质存在时能发生凝集，若再有补体参与，红血球则被溶解。 实验目的 掌握补体测定方法 加深了解补体的作用和激活条件 材料与试剂 试剂 1.抗原：2%绵羊红细胞 2.抗体：溶血素 3.补体：实验室常以健康豚鼠血清作为补体 材料:小试管，生理盐水，水浴箱 实验方法 取试管4支，按下表加入各物 实验方法 将上述试管放在37℃水浴箱内30分钟观察有无溶血现象。 将不溶血试管离心，3000rpm，5min，使红细胞沉淀。 将2、3号管上清液分别移入5、6管，按下表加入试剂 实验方法 实验结果 溶血：液体呈红色透明 不溶血：呈红细胞混悬液 思考题 根据所给的条件，请预测哪几管会溶血？ 哪几管不会溶血？请你详细分析溶血和不溶血的原因。 * * 1、补体经典途径(classical pathway)：是指以抗原抗体复合物为主要刺激物，使补体固有成分以C1、C4、C2、C3、C5～C9顺序发生酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。 同经典途径 参与非特性免疫，在 感染后期发挥作用 参与特异性免疫在感染后期发作用 作用 同经典途径 Mg2＋ Ca2＋ Mg2＋ 所需离子 同经典途径 C3bnBb C4b2b3b C3转化酶 同经典途径 C3bBb C4b2b C3转化酶 同经典途径 C3，C5～C9， B、 P、D因子 C1～C9 参与成分 MBL （甘露聚糖结合凝集素 ） 脂多糖、酵母多糖、 凝聚的IgA和IgG4 IgG1～3或IgM 与Ag复合物 激活物 MBL途径 旁路途径 经典途径 区别点 0.5 0.5 0.5（灭活） 0.5 4 1.0 0.5 0.5 - 3 1.0 0.5 - 0.5 2 0.5 0.5 0.5 0.5 1 结果 生理盐水 2