中国家蚕抗菌肽人工合成类 CM Ⅳ基因在 甜菜夜蛾.pdfVIP

41 卷 　6 期 2001 年 12 月 微 生 物 学 报 Acta Microbiologica Sinica Vol. 41 December 　 No. 6 2001 3 国家自然科学基金资助项目 作者简介 :赵东红 ,讲师 ,在职博士生 ,从事分子细胞生物学方面的研究 ,联系人。Tel :025 - 3598500 ;e2mail :zhaod2 hong @21cn. com 收稿日期 :2000211229 ,修回日期 :2001202203 中国家蚕抗菌肽人工合成类 CM Ⅳ基因在 甜菜夜蛾虫体中的表达 3 赵东红1 　戴祝英1 　周开亚1 　张林元2 ( 1 南京师范大学生命科学院　南京　210097) ( 2 南京军区军事医学研究所　南京　210012) 摘 　要 :将人工合成的中国家蚕抗菌肽类 CM Ⅳ基因与抗菌肽信号肽基因连接 ,经 EcoR Ⅰ、 Hind Ⅲ双酶切后 ,克隆于 pFASTBac Ⅰ的 EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ酶切位点之间 ,得到重组转座载体 pFASTBac2ABP ,经测序证明阳性克隆正确。将重组转座载体转化 HD10Bac 大肠杆菌 ,得到重 组 Bacmid2ABP。将重组 Bacmid 转染 sf21 细胞及感染甜菜夜蛾 ( Laphygma exigua) 幼虫 ,在培养 细胞上清及虫体血淋巴中均测到抗菌活性。经 Northern blotting 证明感染甜菜夜蛾幼虫中有 类 CMⅣmRNA 的存在。且表达产物在酸性电泳中电泳行为与天然抗菌肽 CM Ⅳ组分相似。 为进一步利用昆虫细胞及虫体生产抗菌肽药物打下了基础。 关键词 : 中国家蚕抗菌肽类 CMⅣ基因 , 昆虫杆状病毒表达系统 , Bac2to2Bac 策略 , sf21 细胞 , 甜菜夜蛾幼虫 中图分类号 :Q933 　　文献标识码 :A 　　文章编号 :000126209 (2001) 0620680206 　　昆虫抗菌肽 (antibacterial peptide ,ABP) 是昆虫免疫后产生的一类抗菌多肽[1 ,2 ] 。抗菌 肽 CM Ⅳ是中国科学家首次从家蚕中分离纯化并测定一级序列的[3 ] ,它由 35 个氨基酸残 基组成 ,无免疫原性 ,对热和酸碱稳定 ,具有广谱抗菌及抗癌活性[4 ,5 ] ,有望成为新型的抗 菌抗癌药物。 为了更好地研究抗菌肽的作用机理以及提高其抗菌抗癌活力 ,李秀兰等[6 ] 根据天然 抗菌肽 CM Ⅳ的基因结构 ,在计算机的帮助下 ,对其基因进行了近 60 %的改造 ,设计并合 成了一种新型的抗菌肽基因一类 CM Ⅳ基因。为了模拟天然抗菌肽 ,在其终止密码子前 设计了一个天冬酰氨密码子 AAC ,以便直接翻译出 C2末端带酰胺的多肽。我们虽然已成 功地在大肠杆菌中表达了类抗菌肽基因并得到活性[6 ] ,但是大肠杆菌表达系统还存在内 毒素污染等问题 ,因而影响了表达产物的临床应用。 为了更好地研究该抗菌肽的特性 ,需要构建一个高效表达的体系 ,以制备大量抗菌 肽。Bac to Bac 杆状病毒表达系统是目前最好的杆状病毒克隆表达策略[7 ] ,该系统不需空 斑纯化 ,因此大大减少了鉴定和纯化重组病毒的时间。本文采用新型的 Bac to Bac 杆状 病毒表达系统表达了该抗菌肽基因 ,在 sf21 细胞及甜菜夜蛾 (Laphygma exigua) 幼虫虫体 中得到了抗菌活性。为进一步利用昆虫细胞及虫体生产抗菌肽药物打下了基础。 1 　材料和方法 111 　材料 11111 　质粒、病毒和细胞 : AcNPV 的 Bac2to2Bac 系统 :转座质粒 pFastBac 1、大肠杆菌 DH10Bac、穿梭载体 Bacmid 购自 Gibco BRL 公司 ,大肠杆菌 DH5α为本室保存。 草地贪夜蛾 ( Spodoptera frugiperda)细胞 sf21 由美国南加州大学医学院惠赠 ,细胞在含 有 10 %胎牛血清的 TNM2FH培养基中 27 ℃培养。甜菜夜蛾幼虫从南京农业专科学校购 买。AcNPV 野生病毒由南京大学秦俊川教授赠送。 11112 　试剂 :限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、IPTG、X2gal 均购自大连宝生生物制品公司 , Cellfectin 购自 GIBCO BRL 公司。RNA 购自 Promega 公司。其他试剂均为分析纯产品。 112 　方法 11211 　质粒的构建及酶切鉴定 :参照文献[8 ]进行。 11212 　重组Bacmid 的筛选及转染细胞 :将重组 pFastBac 转化DH10Bac 大肠杆菌感受态细 胞 ,37 ℃复苏 4h 后 ,连续 10 - 1 、10 - 2 、10 - 3 倍稀释 ,分