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细 胞 培 养 技术 广东医学院病理学教研室 邓惠华 组织培养的基本概念和发展简史  早期培养 组织培养的建立与发展 现代组织培养 体外培养细胞的分型 贴壁型细胞 上皮细胞型  成纤维细胞型  游走细胞型 悬浮型细胞 培养细胞的生命期 原代培养期 原代培养与体内原组织很相似，具异质性，相互依存性强，细胞克隆形成率低。此期一般持续1～4周。 传代期 持续时间最长，其特点是细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。 衰退期 细胞培养一代的生长过程 传代是将细胞从一个培养瓶皿转移到另一培养瓶皿内生长 培养一代单个细胞可倍增3－6倍游离期 指数增殖期 停止期 细胞分裂数量 作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要指标，以细胞分裂指数（ mitotic index,MI）来表示。 MI是指100个培养细胞中的分裂细胞数。 一般细胞的MI为0.2％－0.5％，无限传代细胞系或肿瘤细胞的MI可高达 3％－5％。 在传代期培养时应注意的问题 为保持二倍体细胞性质，细胞应在传代后早期冻存（10代内冻存）。 少数细胞系在此期可能发生自发或诱发转化，获得不死性而成为无限细胞系，此时细胞核型多变成异倍体。 建立细胞系（株）的要求 用选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。 一般在原代或2－3代后即大量冻存，作为原种（stock cells），取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻存，这样可保证长期使用和延缓衰老 。 当连续传10代左右时，可按建系、建株要求进行检测或鉴定。 国际上知名的细胞库 ATCC（American Type Culture Collection IMR（Institute for Medical Research）The Human Genetic Mutant Cell Repository，Institute for Medical Research Copewood and Davis Streets，Camden，NJ 08 103 USA JCRB细胞库（Japanese Cancer Research Resources Bank－ Cell Bank） ECACC（European Collection of Animal Cell Cultures） ATCC入库检测项目  组织来源和已传代数：应说明细胞供体所属物种，来自人或动物，个体性别、年龄、取材的器官和组织。肿瘤组织应说明临床和病理诊断及病历号等。细胞培养传代情况。 培养条件及方法：说明使用培养基、血清种类及用量、抗生素、适宜pH等。 细胞活力、细胞生长曲线、分裂指数、倍增时间等。 冻存液 ATCC入库检测项目 融解后细胞生长特性。 接种存活率 细胞生物学检测 细胞形态、特异结构、细胞核型 物种检测 检测同工酶谱，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染。 ATCC入库检测项目 无菌检测 包括细菌、真菌、支原体、病毒等 反转录酶检测 细胞建立者 检测者 鉴定组织 培养细胞的生存环境、条件 无菌环境、 温度、 气体环境和氢离子浓度 基本营养物质 细胞量和培养器皿的清洁度 组织培养设施和基本条件 实验室设计 应保证无微生物污染和不受其他有害因素的影响.具体工作包括无菌操作、无菌处理、洗刷、制备细胞、孵育、传代、细胞冻存与复苏等。 准备工作 功能区 无菌室 净化工作台 无菌箱 设备器材 大型工具类 无菌室、实验室、超净工作台等； CO2培养箱、恒温箱、培养盘等； 显微镜：倒置、普通、照相系统； 普通离心机、冷冻离心机 冰箱：普通、（超） 低温、液氮罐； 药品柜、器具柜、实验台等。 配液用具 蒸馏水制作系统 天平称量系统 pH仪、pH试纸（广泛、精密） 量筒、漏斗、容量瓶等。 消毒灭菌类 高压蒸气灭菌器; 干热灭菌器; 滤过器（蔡氏滤器EKS，玻璃滤器）、 滤过瓶和抽滤泵、微量超滤膜滤器等; 紫外灯，离子发生器; 制备细胞用具 解剖用具、尼龙或不锈钢网、血球计数器等。 培养器皿、培养瓶、细胞培养板等。， 刻度吸管、滴管、试管等。 溶液瓶（不同规格） 恒温磁力搅拌器、恒温震荡水浴箱、涡流混悬器等。 细胞冻存管、真空低温干燥器等。 实验器材的处理 一 器具洗刷 玻璃器皿的清洗 要求：干净透明、无油迹、无残留有害物资或化学品。 步骤：浸泡→刷洗→浸酸→冲洗 浸泡：自来水浸泡过夜，水洗；再用2-5%盐酸浸泡过夜或煮沸30分，水洗； 刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂刷洗杂质，冲洗晾干； 浸酸：4小时以上。（重铬酸钾+浓硫酸） 冲洗：