T-RFLP和454焦磷酸测序方法分析制麦过程细菌-食品与生物技术学报.doc

文章编号:20161009001 T-RFLP和454焦磷酸测序方法分析制麦过程细菌群落的动态变化 邱然1,2,3， 陆健1,2,3 （1.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122； 2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122； 3.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122） 摘要:确定微生物菌群特性是制麦管理与优化的关键一步。本研究以两个不同收获年份及两个同批次不同制麦方式的大麦为样品，采用两种非培养计数方法，即16S核糖体RNA（16S rRNA）末端限制片段长度多态性（T-RFLP）和454焦磷酸测序，检测制麦过程细菌及乳酸菌菌群结构，以期全面、准确分析细菌群落结构及动态变化。研究结果显示：不同收获年份的大麦细菌菌群结构存在差异，整个细菌群落结构随着制麦过程而发生变化，而不同发芽方式之间并没有明显的区别。此外，454焦磷酸测序结果显示乳酸菌有139个运算分类单元（OTU），所有样品有88%的序列覆盖了5个OTU（如Weissella, Lactobacillus和Leuconostoc菌属)，由此说明制麦过程乳酸菌的多样性较低，优势乳酸菌相对数量随着制麦条件变化而波动，并且大麦的收获年份和制麦环境也影响乳酸菌的菌群结构。 关键词：麦芽；微生物菌群；乳酸菌；末端限制片段长度多态性 中图分类号：TS 261.2制麦是一个复杂的生物学过程，包括诸多的生理生化反应。大麦在发芽过程中，激活和合成水解酶类，降解蛋白质和淀粉等大分子物质，转化成氨基酸和糖类供啤酒酵母生长代谢使用[1]。在制麦生态系统中，除了发芽的大麦，还有丰富的微生物菌群[2]，其代谢产物对麦芽品质影响很大，并最终影响啤酒质量。微生物的性质和数量会对制麦过程和最终产物啤酒产生有利或不利的影响[3]。因此，深入了解制麦过程中微生物菌落的性质和数量，有利于控制制麦过程和改善麦芽品质，进而提升啤酒质量[4]。 确定大麦和麦芽微生物组成的传统方法是采用涂平板计数和菌落鉴定的方法。这种方法首先要进行微生物培养。在现阶段，自然界中大多数的微生物都是不可培养的，在实验室中能够培养的菌种仅占自然界微生物种类的极小部分，还有相当多的微生物因无法培养而未被人们所认识。因此，传统方法用于研究制麦生态系统中总微生物构成可能出现严重偏差，导致实验结果与实际不一致[5]。目前，传统方法正逐渐被不需要进行微生物培养的分子生物学方法所补充和替代[6]，如指纹识别技术、基因测序等。其中末端限制片段长度多态性（T-RFLP）分析技术不依赖于细菌培养，并且整合了自动测序仪的高分辨率和高通量特征，重现性好，分辨率高，自动化程度高，能迅速产生大量重复、准确的数据。对于分析复杂的群落结构比其它的指纹识别技术具有更明显的优势，已经被广泛用于生态系统和栖息地中的微生物菌群的多样性和分子动力学的研究[7]。随着科技的不断进步，454焦磷酸测序技术已经能快速鉴定微生物菌落，比克隆和Sanger测序更有效，避免了经典分析技术在多样性研究中的局限性以及由此引起的种群丢失、结构不清等弊病，可以直接反映出生态系统中微生物原始的构成情况，也是研究微生物群体多样性的重要手段。然而，到目前为止，还未见T-RFLP和454焦磷酸测序方法用于分析麦芽制造过程中微生物多样性的报道。 乳酸菌在制麦和酿造工业已有较多应用，如利用乳酸菌在制麦和酿造过程中控制腐败和真菌毒素，以提高麦芽质量和安全性[8]。某些特定的乳酸菌会产生抗菌物质与溶解氧竞争，限制有害细菌的生长，缩短麦汁过滤时间[9]。Laitila等人证明在浸麦水中添加乳酸菌可以提高大麦发芽力[10]。尽管在啤酒酿造工业中乳酸菌的重要性已经得到了高度认可，但到目前为止，大部分研究主要集中在个别菌株上[11]，与大麦和麦芽制造过程相关的乳酸菌菌群结构和特性尚未得到详细研究。 本研究以两个不同收获年份、同批次但不同制麦方式的大麦为样品，利用T-RFLP技术系统考察了细菌菌落结构变化情况，并重点研究了制麦过程中的乳酸菌。另外，使用454焦磷酸测序技术对乳酸菌16S rRNA基因进行测序，研究制麦过程中内源性乳酸菌菌群特性。 1材料和方法 1.1材料和仪器 实验材料：2012年和2013年的国产江苏啤酒大麦单二。麦芽制造由塔式制麦系统和微型制麦系统按照相同的制麦工艺进行。浸麦：4W -7D- 5W- 7D -5W- 3D，浸麦度43-44%；发芽：15℃，120h；干燥：45℃3h - 1h - 55℃ 3h-1h-65℃ 3h-1h-70℃ 1h-1h-75℃ 1h-1h-87℃ 3h。取样点设在发芽1天、发芽5天和最终成品麦芽。所有供试样品由中粮麦芽（大连）有限公司提供。 实验仪器：微型制麦设备，澳大利亚Jeo White