免疫共沉淀步骤例析.docVIP

在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。 1.1.1 免疫沉淀 1）蛋白提取 （1）取10盘长满10 cm 大皿的Hep G2细胞，弃去培养基，用预冷PBS清洗细胞3次，吸净PBS残液。 （2）加预冷的裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）至培养皿中（每皿500-1000 ul），冰上孵育30 min。 （3）用细胞刮刮取，收集细胞裂解液并移至离心管，4℃离心13,000 g，10 min。 （4）将上清移至新离心管中，可用于蛋白浓度测定或远期研究。 2）准备磁珠 （1）将protein A和protein G珠子分别摇晃5 min混悬，各吸取50 ul珠子到1.5 ml EP管中，组成100 ul 珠子混合物。 （2）小离心机离心20-30 s，去上清。 3）结合抗体 （1）将肝细胞癌患者血清20 ul 和200 ul Ab Binding Washing Buffer 加入上述EP管中。 （2）室温旋转10 min孵育。 （3）小离心机离心20-30