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免疫酶技术 Immunoenzyme technique 概述： 70年代初在免疫荧光技术基础上建立。 较IF、RIA(radioimmunoassay)更优 越 , 具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点 原理： 利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ab、Ag)有无及含量多少。 Ag + AbE AgAbE + 底物 呈色反应 免疫酶技术具有 特异性— Ag、Ab反应 敏感性— 酶的高效催化作用 两种方法: 酶免疫组织化学染色技术（免疫组化） 酶免疫测定法（酶联免疫吸附实验，Enzyme-Linked immunosorbent assay,ELISA) 常用的酶 （一）选择酶的要求 1.自然界存在广，易获得 2.易纯化、性稳、活力高 3.形成的酶结合物稳定，并保留酶、 抗体或抗原的活性 4.底物来源方便并易保存 5.反应后有色产物能快速测定 6.酶分子量不能太大，太大不易进入组织细胞内，影响组化染色定位 （二）常用的酶 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶等 辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP) 一种铁卟啉蛋白质，分子量4.4万，能进入细胞内 酶活性强，酶结合物可长期保存 最适pH为5.5左右 选用时注意酶纯度和活性 纯度：RZ表示，反映酶含量与蛋白含量之比，最好要RZ值为3.0左右 活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mg HRP的底物： 邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺（TMB） 反应体系中作为供氢体 DH2+H2O2 D+2H2O 供氢体 受氢体 有色产物 HRP OPD特点： 有色产物为黄色 空白对照接近无色 敏感度高，有致癌作用 TMB特点： 有色产物为蓝色 无致癌作用 底物系统（包括供氢体、 受氢体） 临用时配，配后避光保存 酶联免疫吸附实验 （Enzyme-Linked immunosorbent assay） ELISA 一.原理： 将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物），当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量。 固相载体 聚苯乙烯 Ag或Ab吸附到固相载体上的过程,称为包被 (酶免疫测定法) 实验中所需酶标抗体的制备方法同荧光抗体制备： 纯化后的抗体+酶 透析去除游离酶 测定酶标抗体工作浓度 试验中有关术语及试剂： 包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后，不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB 洗涤(wash)：PH7.2-7.4 PBS 酶结合物 ：酶标抗体或酶标抗原 终止液：2M H2SO4 OPD： HRP催化后其有色产物为黄色，H2SO4终止后变为橙色（棕色）。 TMB： HRP催化后其有色产物为蓝色， H2SO4终止后变为黄色 二.方法类型和操作步骤 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法步骤： 包被已知Ab 洗涤 加待测标本（测Ag？） 洗涤 加酶标Ab 洗涤 加底物 加终止液 观察结果 双抗体夹心法的基本实验过程 洗涤三次 终止液 该法主要用于检测抗原 包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体 每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦 （二）间接法测抗体 步骤： 包被已知Ag＋待测标本（测Ab？） ——反应一段时间后，洗涤——加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）——洗涤——加底物——加终止液 ，观察结果。 该法主要用于测抗体 酶标记一种抗抗体可以用于多种抗 体的检测 包被抗体 加标本（抗原） 加抗体 加酶标抗抗体 间接法测抗原 （三）双位点一步法 步骤：包被抗体A＋待测标本 ＋酶标抗体B ——洗涤，＋底物——终止液，观察