第六章表达教程范本.pptVIP

第六章;第一节 克隆基因与表达系统 ;;三、克隆真核基因在原核系统表达的4个困难及其克服的方法: 但是由于原核,真核基因结构及其表达调控上存在巨大差别，因此，克隆真核基因在原核系统表达存在4个困难,其解决方法如下：;四、目前常用的原核\真核生物表达系统 目前常用4种表达系统： （一）E.coli 表达系统； （二）酵母 表达系统； （三）昆虫表达系统； （四）哺乳类细胞表达系统。 （一）、（二）、（三）、（四）各有其优缺点 选择哪一种表达系统,取决于: 1.?基因结构; 2.?蛋白质性质 3.??实验室条件等。 ;第二节 克隆基因在原核细胞中表达(以E.coli为代表) ——克隆真核基因在大肠杆菌的表达;二、 诱导目的基因在E.coli表达的基本要素; ;(二)原核表达载体的选择与可供选择的原核表达载体;(三)载??/目的基因的连接 表达载体连接中的关键问题是阅读框匹配。;(四)受体菌选择和诱导条件 1．受体菌与表达载体匹配 T7启动子→需要宿主表达T7RNApol 2．诱导条件由启动子决定 T7启动子→IPTG诱导 使用强的可以调控的T7启动子，外源基因可获得高效表达，一般细胞总蛋白的10℅‐70℅。借助信号肽外源基因产物可分泌至周质间或胞外。;三、融合蛋白的表达 (一)融合蛋白(fusion protein) 融合蛋白即编码原核多肽DNA序列与编码真核多肽cDNA融合成一体后表达出来的一种蛋白。N端由原核DNA序列编码，C端由真核基因完整序列cDNA编码。 (二)融合蛋白表达的5个优点及其意义 ⑴伪装不易降解 其中真核蛋白由原核多肽伪装，不易被细菌蛋白酶降解，稳定； ⑵大多数以可溶性形式存在，不需切割就有生物活性； ⑶易酶切分离 如肠激酶或设计酶切位点切掉原核多肽，即可释放出有活性的真核蛋白； ⑷易分离纯化 如用原核多肽/或融合蛋白免疫家兔产生相应单抗亲和，纯化实验操作简单； ⑸产生分泌性蛋白 若E.coli结构基因是一段信号肽，可产生分泌性产物。;(三)融合蛋白表达的必要条件–阅读框匹配 1．阅读框（reading frame读码） mRNA核酸序列中，3个核苷酸为一组，称为密码子，由核糖进行翻译。每个密码子代表蛋白合成中的单个AA，阅读框规定了那3个核苷酸为1组读作密码子，这是由起始密码AUG决定的。如：AUG GCA AAA UUU CCC…读作AUG/GCA/AAA/UUU/CCC/…, 而不能读作A/UGG/CAA…。 2．基因阅读的3个特点 ①每个基因都有特定的阅读框，阅读必须从第一个字母开始，到最后1个字母结束； ②阅读是不停顿的，停顿只能合成肽而非蛋白； ③阅读方向5′→3′，合成肽链方向N→C，而不能反之。 ;3．融合蛋白质的阅读框是由原核多肽的起始密码AUG决定的： 5’－P－SD－AUG－Peptidegene－MCS－真核cDNA插入点－3’ |－Ecoli表达载体原核多肽基因及3’MCS |－衔接点 |－真核基因CDNA － 许多情况下，由于cDNA的插入（到原核多肽3’端的）MCS，使之于原核载体上其实密码子AUG的阅读框不相符，造成原核多肽及cDNA的框移，结果造成表达错误或者不表达，因此必须调整二者的阅读框，使之匹配。（此为本章第三个难点） 解决阅读框匹配这一难题已有4种办法，其中以位相载体最为实用，如下： ;原核细胞表达IL2试验流程 1. 构建IL2基因文库或其他方法获取IL2基团 2.PCR扩增IL2 3.构建PUC18IL2测序载体 4.构建PUR/IL表达载体 5.转化大肠杆菌DH5α 6.转化菌培养（工程菌发酵） 7.裂菌 8.上清液(NH4)2SO4分级沉淀 9.层析分离 10.?样品鉴定 ;四、非融合蛋白的表达 （一）非融合蛋白的表达载体结构 5’原核启动子－SDs－ATG－真核基因结构－终止密码子－3’ 以限制酶NdeI或’NcoI位点引入ATG 有些原核载体SDs下游构建了1个NdeI或NcoI酶切位点，切割修饰目的基因－用合适接头连接－并从NdeI或NcoI位点引入起始密码子ATG。 （二）非融合表达载体表达蛋白的性质 1.表达蛋白与天然蛋白在结构功能