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细菌内毒素检查法2008年12月 郑州 中国药品生物制品检定所 蔡 彤 一、背景介绍 热原 细菌内毒素 细菌内毒素检查法反应机理 热原 热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质 细胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ） 内源性热原 产生细胞分裂素的物质 内毒素热原 外源性热原  非内毒素热原（病毒、细菌、真 菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素） 细菌内毒素 细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分之一 化学结构 含有3个不同的区域 ? O-特异侧链? 核心多糖? 类脂A 细菌内毒素 致热性 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原 性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢， 引起发热反应 耐热性 分子极性 多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性 在水中呈不均匀分布 酸碱性与 强酸强碱水解反应 鲎反应性 C因子 活化的C因子 内毒素 活化的B因子 B因子 凝固酶 凝固酶原 凝固蛋白（凝胶） 凝固蛋白原 二价阳离子 β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM 活化的G因子 G因子 细菌内毒素检查法反应机理 能与鲎的血液提取物可发生发生多级酶促反应，形成凝胶 细菌内毒素检查法反应机理 在药品生产质量管理规范（GMP）条件下进行药品生产的质量控制，一般可以接受的观点是，不存在内毒素就意味着不存在热原 通过检测内毒素控制药品中的热原 Boc-leu-Gly-Arg-PNA （鲎三肽） 活化的C因子 C因子 内毒素 活化的B因子 B因子 显色法 凝胶法，浊度法 凝固酶 凝固酶原 凝固蛋白（凝胶） 凝固蛋白原 细菌内毒素检查法定义： 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 二、细菌内毒素检查法介绍 细菌内毒素检查包括： 限量实验 凝胶法 半定量实验 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 浊度法 动态浊度法 光度测定法 终点浊度法 显色基质法 动态显色法 终点显色法 二、细菌内毒素检查法介绍 细菌内毒素检查 凝 胶 法 细菌内毒素检查----------凝胶法 1、综述部分 实验原理 实验准备 限值（L）的确定 确定最大有效稀释倍数（MVD） 2、实验部分 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验 正式干扰实验 检 查 法：限量试验 半定量试验 C因子 活化的C因子 内毒素 活化的B因子 B因子 凝固酶 凝固酶原 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶） 二价阳离子 1、凝胶法实验原理 37± 1℃下保温反应60?2分钟 当样品中细菌内毒素的浓度达到或超过鲎试剂的灵敏度时，凝集为坚实凝胶，为阳性，记为“+”。 当样品中细菌内毒素的浓度未达到鲎试剂的灵敏度时，不能凝集为坚实凝胶，为阴性，记为“—”。 1、凝胶法实验原理 2、凝胶法实验的准备 实验所需物品 细菌内毒素标准物质 细菌内毒素检查用水 凝胶法鲎试剂 漩涡混合器 适宜的恒温器 37± 1℃ 电热干燥箱 250 ℃ 实验器械等 细菌内毒素标准物质 国家标准品 以内毒素国际标准品为基准标定效价