不同光生物反应器对坛紫菜丝状体培养的比较研究-海洋科学.doc

(不同光生物反应器培养坛紫菜 丝状体的比较研究 邓祥元1,2张薇1,2姜鹏1秦松1,* （1中国科学院海洋研究所，青岛 2660712中国科学院研究生院， 北京 100049） 紫菜作为一种大型红藻，是目前世界上人工栽培经济价值最高的一种栽培海藻，全世界人工栽培海藻的总产值近3×109美元，其中紫菜的产值近2×109美元，约占2/3。紫菜不仅含有丰富的蛋白质、碳水化合物，而且各种维生素和矿物质的含量也特别丰富Rupérez　et al.,2002; Dinabandhu et al.,2002），其中紫菜的多糖及藻胆蛋白等成分具有药用价值，以紫菜为原料从中提取高附加值的产品。因此利用紫菜可以开发保健食品和生物药物，具有很大的市场价值和开发潜力。 紫菜还可以作为海洋科学基础研究和应用研究的模式生物，根据紫菜的遗传学特性，如具有较小的基因组（大约2.6×108个碱基）和较少染色体（2~7条）使它符合基因组学研究的许多标准，因此被广泛应用到基因组水平和遗传转化的研究。 紫菜具有异型世代交替的生活史，其丝状体阶段可在实验室人为控制下保持长期的营养增殖状态而不发育，而当改变培养条件时，又可使其在短时间内迅速发育，起到了陆地作物种子的作用。我们曾利用紫菜丝状体在光生物反应器中进行培养，获得了较好的效果，验证了光生物反应器培养坛紫菜丝状体的可行性。 光生物反应器培养藻类细胞已有70多年的历史，但主要以微藻的大量培养为目标，而对大型藻类细胞及组织培养的研究较少。面对众多不同类型的生物反应器，选择时不仅要考虑光照、温度控制、气体传输、营养物质传输及混合情况等因素，还要考虑反应器的制作成本及所需的实验成本等。气升式内环流生物反应器和鼓泡式生物反应器结构都较为简单，气体从底部通过喷嘴或孔盘穿过液体实现气体传递和物质交换，其内部都不含转动部分，整个系统封闭，易于无菌操作，而且无需机械能消耗。这两种生物反应器不仅符合生物反应器的选择标准，而且操作简单，成本低廉，而且被广泛应用到微生物和动植物细胞的大规模培养。本研究利用上述两种生物反应器培养坛紫菜丝状体营养细胞，以比较不同类型的生物反应器对细胞生长的影响，并进一步优化坛紫菜丝状体的条件，以期获得较高的生物量和适宜快速增殖的培养方案，解决优良品种容易退化、优质产物的产量低等困扰紫菜栽培业的难题。 坛紫菜（Porphyra haitanensis）丝状体BD-f-02品系由宁波大学海洋生物工程重点实验室（浙江宁波）提供，克隆最初来自单个孢子体细胞，经长期营养增殖形成丝状藻丝。 培养液采用PES配方（1000ml海水中添加2ml PES母液；pH=7.8）Wang et al.,1987）。培养液用天然海水配制，由中国科学院海洋研究所水族楼提供砂滤海水，静置，用8μm滤纸过滤除去杂质，装入5L玻璃三角瓶中并在电炉上煮沸，冷却，在超净台（北京半导体设备一厂）中分装。 首先将坛紫菜丝状体用载玻片磨碎、清洗后重悬于300ml玻璃三角瓶中（装液150ml），并置于温度为20oC，光强为40μE m2 ·s，光周期为14L/10D的光照培养箱（宁波江南仪器厂）中，每天摇动三次，5~10s/次，培养一周并测定初始密度后，接种于光生物反应器中。 反应器玻璃主体包括两部分，圆柱体部分和圆台体部分圆柱体部分直径为8cm，高度为60cm；圆台体部分上部直径为8cm，下部直径为2cm，高度为15cm。整个反应器工作体积为2500ml。反应器上部具有接种口、取样口、加料口和空气出。 反应器玻璃主体圆柱体部分和圆台体部分圆柱体部分直径为8cm高度为cm，提升管直径为4cm，高为50cm；圆台体部分上部直径为8cm下部直径为2cm高度为5cm。整个反应器工作体积为2500ml。反应器上部具有接种口、取样口、加料口和空气出口。先将生物反应器硅烷化、蒸汽高压灭菌（121oC，15min）后，固定于光照培养箱中。根据光生物反应器基本培养条件（表1），由接样孔加入坛紫菜丝状体细胞，加入合适的营养盐和培养液后，打开气泵，调整气体流量并控制温度。 ― 反应器类型 2500ml 鼓泡式光生物反应器 /2500ml气升式内环流光生物反应器 温度 (oC) 20 培养周期(day) 20 入射光强 (μ mol photons m-2 s-1) 40 光周期 (h(light)/h(dark)) 14:10 初始细胞密度 (mg/L) 700 通气速率 (v/v/m) 1.2 无机氮源浓度(mM NaNO3) 15 无机磷源浓度 (mM Na2HPO4) 0.6 3.测试及分析计算方法 (1) 藻细胞密度（用mg DCW/L表示）的测定 测定细胞之前，先摇匀待细胞，取一份0ml样品通过孔径为0.2μm的滤膜过滤, 然后于