甜菜树贝壳杉烯合酶基因的克隆与表达-食品与生物技术学报.doc

甜菜树贝壳杉烯合酶基因的克隆与原核表达 刘洪伟#，王帅1#，王强2，王伟3，杨艳芳1，刘锡葵4*，邱德有1* （1.林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所，北京100091；2. 四川农业大学农学院，成都 611130；3. 中国医学科学院，中国协和医科大学药物研究所，北京 100050；4.中国科学院昆明植物研究所，植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，云南昆明 650204） 摘要：甜菜树是我国特有的野生食用木本蔬菜植物，可食用部位是嫩茎叶。目前对甜菜树仅在生理生化、组培方面进行了一定地研究，在基因方面的研究还很少。赤霉素能促进蔬菜的叶片扩大和茎伸长生长，促进侧枝生长、抽苔等营养生长。该文研究赤霉素合成途径中的关键酶-贝壳杉烯合酶，对其功能的研究可以为以后优化品种提供基因层面的基础。首先通过RACE-PCR技术，从甜菜树叶片中克隆得到贝壳杉烯合酶基因（Ent-kaurene synthase gene，YlKS）的全长cDNA，共2512 bp（GenBank登录号为KP872698），其ORF长度为2232 bp，共编码743个氨基酸，预测蛋白分子量大小为84.987 kD，蛋白等电点为5.264，表明该蛋白呈酸性。将该基因构建到表达载体pET32a中，得到重组质粒pET-32a-YlKS。通过将pGG/An2、pIRS和重组质粒pET-32a-YlKS三个质粒共转入菌株BL21(DE3)中，得到重组菌株，并进行发酵。通过SDS分析发现，重组蛋白成功得到了表达。最后通过对发酵产物进行萃取，并使用GC-MS进行检测，确定了该基因所编码的酶确实是贝壳杉烯合酶。 关键词：甜菜树；贝壳杉烯合酶；原核表达；气质联用 中图分类号：文献标识码： Cloning and Expression of the Ent-kaurene Synthase Gene from Yunnanopilia longistaminata (W.Z.Li, C.Y.Wu et D.Z.Li) (Opiliaceae) LIU Hong-wei1，WANG Shuai1，WANG Qiang2，Wang Wei3，YANG Yan-fang1，Liu Xi-kui4*，QIU De-you1* (1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, The Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091 China；2. College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China；3.Institute of MateriaMedica, Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing 100050, China；4.State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resourses in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, China) Abstract: Yunnanopilia longistaminata is a wild woody vegetable in China, and its tender stems and leaves are edible. So far, the research of Y. longistaminata mostly focused on tissue culture, physiology and biochemistry, while less concentrated on gene level. Gibberellin(GA) can promoter vegetative growth, such as the bolting and the growth of stems and leaves. Using molecular biology methods, we studied ent-kaurene synthase,the key enzymes in the pathway of gibberellins synthesis in this species. The study of the function of ent-kaure