项目进展-生物分子高效分离与表征研究组.doc

国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划） 项目编号：20CB910600 项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究2012年1月日 年度计划执行情况年度计划完成情况低残留的磁性材料、整体材料、蛋白质均衡器固载基质以及超细粒径分离材料18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法、iTRAQ 结合 18O标记相对定量技术、针对非标记定量技术的归一化新算法，并编写了定量软件pQuant；建立了内标肽段制备、表征和含量测定等方法、基于多反应检测（MRM）MALDI-MS技术的金属元素标记多重相对定量方法研究；研制了低残留蛋白质传质膜材料、缓冲溶液置换接口、亲水性酶解反应器等，开展了在线固相标记、集成化蛋白质定性和定量平台构建以及超高灵敏度蛋白质定量分析系统按项目任务书的规定，全面完成任务书中要求的阶段性目标。已发表论文篇，其中SCI收录篇；申请发明专利项，授权专利项；培养研究生人研究工作的主要进展 在低残留的样品预处理新材料方面：1）研究了基于原子转移自由基聚合反应（ATRP）在磁性微球材料表面键合可控链长的聚合物链段的方法，探索了不同长度和种类的链段与蛋白质在材料表面残留间的关系，制备了新型的亲水性刷型聚合物磁性纳米颗粒，并将其用于大规模分析人血清糖蛋白质组，共鉴定到106个糖蛋白的204个糖基化位点；2）研究了基于可逆加成-断裂链转移自由基聚合RAFT）制备可控链长的聚合物微球材料的方法，并结合蒸馏沉淀聚合制备了一种新型表面硼酸基团可控的核壳结构的聚合物纳米材料，实现了蛋白质的高选择性富集；3）分别以分子印迹材料和硼酸为高选择性配基，以点击化学为键合方式，制备了核壳卫星型高选择性配基修饰的磁性材料；4）发展了基于三磷酸腺苷配基的固定化金属离子磁性纳米材料，用于磷酸化肽富集和定量，将其检测限降至3 amol，且17条磷酸化肽段和2条磷酸化蛋白质具有显著差异。4）基于比大表面积的石墨烯，研制了C8修饰的三明治结构介孔石墨烯复合物，并用于内源性肽段的富集，在鼠脑组织中选择性地富集到89个内源性肽段；5）研制了石墨烯/二氧化钛复合材料，用于磷酸化肽段的选择性富集，对磷酸化肽的检测限可以降至2×10-9 M；6）研制了具有等级孔结构的含钛磷酸铝5型分子筛介孔材料，并将其成功用于磷酸化肽的高选择性富集。 在蛋白质均衡器技术方面：发展了基于噬菌体展示单链可变区片段文库（scFv@M13）为配基的蛋白质均衡器，并将其用于血清蛋白质组样品经均衡器处理血清后，鉴定蛋白数目从280个提高到560个，展示了该在高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质富集方面、以及提高蛋白质组鉴定覆盖率方面的重要作用。 在蛋白质组样品分离材料方面：1）制备了粒径分布较窄、粒径可控的亚2μm核壳结构硅胶色谱填料基质，并实现了多肽的快速分离；2）采用苄基甲基丙烯酸酯和硅氧烷为原料，通过一锅法制备了苯基-硅胶杂化整体柱，最小理论塔板高度为8.38 μm，对应的理论塔板数为119,000 理论塔板数/米对种蛋白的酶解产物进行了分离分析，计算得到12 cm整体柱的峰容量为144；3）通过一步升温的改进型一锅法制备了两亲性的有机-硅胶杂化整体柱，对肽段混合物进行分离，最高柱效可达到110,000理论塔板数/米；4）基于巯基-烯烃的点击化学反应这一固定相键合新方，设计了新型的两性离子亲水作用色谱固定相，该固定相不仅具有优异的分离选择性和分离效率，还克服了常用亲水作用色谱固定相化合物适用范围窄的问题；5）基于水平共聚的技术，发展了反相/弱阳离子交换（C18/WCX）的混合模式色谱固定相，在不同pH条件下，C18/WCX柱与C18的正交性优于商品化C18固定相的正交性。在二级质谱定量方面：发展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量新方法该方法针所发展的基于二级质谱by离子定量方法的局限性，一种适用于所有蛋白样品分析、基于常规的酶解、价格低廉的等重标记的b, y离子对二级质谱定量方法，对定量蛋白质组学研究具有重要的现实意义。在目标糖蛋白质定量方面发展了iTRAQ 结合 18O标记相对定量技术该方法用18O酶促标记，在糖基化位点处引入质量标签，可实现糖肽的定量；在肽段层面上引入iTRAQ质量标签，可实现多组样品的同时定量；由于在糖肽、非糖肽中均引入了质量标签，可以实现糖基化程度和蛋白水平的同时定量。MRM技术的蛋白质核心岩藻糖基化水平相对定量的策略，结合18O稳定同位素标记技术，对健康血清和肝癌血清中6个生物标志物候选蛋白质7个核心岩藻糖基化位点的修饰变化水平进行相对定量检测。 在二级质谱定量的算法方面发展了通过提取串级质谱中 b，y 碎片离子对的峰强度信息来得到肽段和蛋白的定量信息的ITMSQ算法为了避免串级质谱图中by碎片离子对共碎裂谱图对肽段正确定性的影响，在ITMS