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半薄/超薄切片技术 董 凤 琴 2010-3 背景： 一、超薄切片技术介绍 超薄切片的基本要求: 固定地好 渗透包埋地好 切地好 载网膜做地好 染地好 超薄切片主要步骤 ★取材 ★固定 ★漂洗、脱水 ★渗透、包埋 ★超薄切片 ★超薄切片染色 1 取材 1.1 取材的基本要求 ? (1)动作迅速，取材后快速放入固定液中； (2)体积要小，一般1㎜3，如果来不及，例如野外取材，也可将组织修成（1×1×2）mm大小长条形，之后再进行分割。 (3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、挫伤与挤压组织。 (4)低温操作，最好在低温(0℃～4℃)下进行，降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。 (5)取材部位要准确。 1.2 取材方法 材料放在洁净的韧性较大的纸上 滴上预冷的固定液 用刀片将组织切下并修小 用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。 植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。 2 固定 (抽气) 2.1?固定的目的 ︾ 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。 ︾ 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，牢固地固定在它们原来所在的位置上，不发生位移。 ︾ 良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。 2.2 常用固定剂 (1)四氧化锇 (OsO4)-- OSMIUM TETRAOXIDE ※强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白； ※固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原； ※具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好； ▼酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定； ▼与乙醇/醛类反应生产沉淀－－漂洗 ●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25㎜； ●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难； ●锇酸固定液常用浓度：1％－2％; 极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心! (2)戊二醛 ( ?C5H8O2)--glutaraldehyde ※有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好； ※渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等； ※保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究； ※对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度:0.5~1mm ,0－4℃可长时间固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材; ▼缺点:不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。 (3)甲醛-Formaldehyde ※渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好； ※细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛； ▼缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失； ＊常用多聚甲醛－戊二醛的混合固定液。 (4)高锰酸钾 ※强氧化剂，较好固定脂蛋白; ※对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂； ※只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定. 3漂洗、脱水 3.1漂洗 漂洗的目的: ☆组织固定后脱水前的漂洗: 清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察. ☆双重固定中,在锇酸固定前的漂洗: 避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构. 3.2 脱水 目的 将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。 方法 用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。 注意事项 脱水梯度逐级进行, 急剧脱水会引起细胞收缩。（ 30% →50%→70%→80%→95%→100%→100%）; 更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡，影响渗透； 脱水过程中应在70%脱水剂中4℃停留或过夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难; 置换用脱水剂：环氧丙烷（Epon812）、二甲苯（石蜡）。 4 渗透和包埋、聚合 4.1渗透渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程。 包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，经加温或其他条件，能聚合成固体，以便进行超薄切片。 4.2 包埋、聚合 包埋操作： 将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或胶囊中，一定条件下可聚合硬化，形成包埋块。 常用的包埋剂 ◆水溶性树脂－丙烯酸类树脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等，适于进行组