荧光定量PCR检测技术的研发进展解决方案.ppt

* 标本体积 磁性纳米颗粒分离方法可以靶富集基因，特别是对于低丰度的标本能够通过增大标本体积，提高检测的下限 提高敏感度 100倍。 * PCR仪 逐孔扫描检测模式检测准确性高，对低拷贝的标本检测有明显的优势，罗氏 cobas taqman 480 为逐孔扫描模式。安普利Genelight9800为逐孔扫描模式。 * 讲解一下扩增曲线的四个区，及理论数学模型建立的前提条件是各样本间包括标准品间的核酸提取效率一致。 * 用于定量的外部标准品有两种处理方式，一种是不经过核酸提取，直接进行扩增，其主要成分是裸露的质粒，因此无需进行细胞裂解核酸提取，这类标准品生成的标准曲线稳定，所以实际上不必每次都做标准品，做的话每次标准品Ct值也是差不多的。当然它的缺点是1无法消除核酸提取过程中的系统误差，举一个比较夸张的例子，比如说一把移液器不准了，取50ul的样本实际上只有25微升，这样取到的样本量就偏少，但标准品因为没有经过核酸提取而没有受到影响，这样会导致检测结果比试剂结果变为原来的1/2,第2是丢失了标准品的部分质控功能，标准品可以反映质控信息，因为此类标准品没有参与核酸提取，所以对核酸提取过程中出现的核酸丢失、抑制因素的存在、样本间交叉污染等无法进行监控。这些导致了使用这种标准品进行定量的精密性不好。 第二种是和临床样本经过相同的核酸提取操作的标准品，这类标准品就没有上述标准品的缺点，它可以（1）可以消除系统误差；（2）可以反应质控信息；（3）定量精确，但是需要每次都做标准品才能体现优势，否则和上述标准品实际上是一样的。 * PCR检测系统组成包括PCR仪及配套设备、PCR试剂盒和操作人员。一份样本的检测结果受到整个检测系统性能的影响，自动化程度越高的仪器，比如包含自动核酸提取功能和扩增分析功能的基因工作站，人员因素对结果的影响越小。 * 荧光定量PCR检测的研发进展 厦门安普利生物工程有限公司 曾庆华 aplywb@126.com PCR检测系统的组成 PCR检测系统的组成 厦门安普利生物工程有限公司 模板制备进展（磁性分离取代加热法） 1、破碎细胞或病原体，释放目的基因 荧光检测试剂优化 厦门安普利生物工程有限公司 裂解液 释放目的基因 破碎细胞、病原体 充分水解结合在核酸上的组白质 模板制备进展（磁性分离取代加热法） 荧光检测试剂优化 厦门安普利生物工程有限公司 水解 未水解 DNA\RNA酶 基因完整 扩增效率高 检测重复性好 基因降解 扩增效率低 检测重复性差 模板制备进展（磁性分离取代加热法） 洗脱：细胞碎片 中分子物质 重金属离子 荧光检测试剂优化 厦门安普利生物工程有限公司 洗涤液 抑制因子吸附到非特异性颗粒上 细胞碎片 磁性纳米颗粒选择性吸附核酸 模板制备进展（磁性分离取代加热法） 荧光检测试剂优化 厦门安普利生物工程有限公司 磁性纳米颗粒 模板制备进展（磁性分离取代加热法） 基因富集作用 荧光检测试剂优化 厦门安普利生物工程有限公司 洗脱液 模板制备进展（磁性分离取代加热法） 荧光检测试剂优化 厦门安普利生物工程有限公司 模板制备的自动化 容易污染 手工 无法胜任 步骤 繁琐 操作 复杂 容易 污染 自动化设备 厦门安普利生物工程有限公司 荧光检测试剂优化 液体处理的自动化 1、从标本管取样到PCR扩 增系统配制全程自动化； 2、一次 处理 96个标本，4 只移液器同时处理通量大， 速度快； 3、采用一次性滤芯Tip头， 非接触液面检测系统， 避免交叉污染； 4、100%外排净化层流通风 系统 ，避免遗留污染，生物 安全性好； 5、血清、血浆、分泌物标本 可以同时处理，并行检测多 种项目，适合临床使用。 ANAS1000 仪器自动化进展趋势 厦门安普利生物工程有限公司 仪器自动化进展趋势 厦门安普利生物工程有限公司 仪器自动化进展趋势 厦门安普利生物工程有限公司 PCR 反应体系的研究进展（提高检测的准确性稳定性） 增加反应体积提高准确性 标本体积发展方向 厦门安普利生物工程有限公司 低浓度样本 标本体积 ≥ 50ul 标本体积 ＜ 50ul Ct值28.5 Ct值33.0 检测下限↑ 敏感度↑ PCR 反应体系的进展 启用新型聚合酶 反应体积发展方向 厦门安普利生物工程有限公司 热启动Taq 高温RT PCR 普通 Taq HotStar 高温RT 55 准确性 重复